Nouveau mode de fermeture défectueuse du tube neural dans le non - Le lac des cygnes de Shijiazhuang Co., Ltd

Rapports scientifiques volume 5, Numéro d'article : 16917 (2015) Citer cet article

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Une correction de l'auteur à cet article a été publiée le 30 mars 2022

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La non-fermeture du tube neural entraîne des malformations congénitales dont la gravité va du spina bifida à l'anencéphalie létale. Peu de facteurs de risque génétiques pour les malformations du tube neural sont connus chez l'homme, soulignant le rôle critique des facteurs de risque environnementaux, tels que le diabète maternel. Pourtant, on ne comprend pas bien comment le métabolisme maternel altéré interfère avec le développement embryonnaire et avec la neurulation en particulier. Nous présentons des preuves de deux modèles murins indépendants de grossesse diabétique qui identifient la migration altérée des cellules mésodermiques naissantes dans la séquence primitive comme la base morphogénétique sous-jacente à la pathogenèse des anomalies du tube neural. Nous concluons que la gastrulation perturbée explique non seulement les défauts de neurulation, mais fournit également une étiologie unificatrice pour le large spectre de malformations congénitales dans les grossesses diabétiques.

La non-fermeture du tube neural entraîne des malformations congénitales1,2, dont la gravité va du spina bifida occulta asymptomatique et des cas de spina bifida corrigibles chirurgicalement à des conditions mortelles telles que l'exencéphalie et l'anencéphalie. Environ 400 gènes ont été identifiés chez la souris où des mutations provoquent ou contribuent à des défauts de neurulation3,4. En revanche, relativement peu de facteurs de risque génétiques sont connus chez l'homme5, soulignant le rôle crucial des facteurs de risque environnementaux, tels que la carence en acide folique6 ou le diabète maternel7,8,9,10. Cependant, malgré un meilleur apport alimentaire en acide folique et un meilleur contrôle glycémique, l'incidence des anomalies du tube neural (ATN) n'a été réduite que partiellement11,12. Le risque actuel d'anomalies du tube neural exige une meilleure compréhension de la manière dont les facteurs environnementaux interfèrent avec le développement embryonnaire en général et avec la neurulation en particulier.

La souche de souris diabétiques non obèses (NOD), qui est susceptible de développer spontanément un diabète auto-immun, est un modèle établi pour le diabète humain de type I13,14. Les embryons de grossesses diabétiques NOD sont affligés d'un taux très élevé d'anomalies du tube neural15 (ATN) et de malformations cardiaques16,17, une autre caractéristique de la tératogénicité du diabète. Nous rapportons ici que la supplémentation périconceptionnelle en acide folinique chez les mères diabétiques NOD a réduit l'incidence des MTN de 40,2 % à 21 % (p = 0,006, Fig. 1 supplémentaire). Ainsi, parallèlement aux grossesses humaines, les MTN de ce modèle sont partiellement sensibles au folate.

De manière inattendue, nous avons constaté que chez les embryons de mères NOD hyperglycémiques, la plaque neurale présentait un tissu ectopique saillant à divers endroits le long de l'axe antéro-postérieur (Fig. 1a – f). Les protrusions étaient strictement limitées aux grossesses diabétiques et se produisaient chez 25,3 % des embryons à 8,5 jours de gestation (E8.5). Pour tester si les saillies étaient uniques à la souche NOD, nous avons induit une hyperglycémie chez les femelles de la souche FVB avec de la streptozotocine18, ce qui a entraîné une incidence de MTN de 21,6 %19. À E8.5, 12,9% des embryons FVB exposés à l'hyperglycémie présentaient des saillies (Fig. 1g, h). L'apparence générale, l'emplacement le long de l'axe antéro-postérieur et l'organisation interne (Fig. 1k) des saillies étaient étonnamment similaires au phénotype des embryons NOD exposés. Ainsi, ces malformations ne sont pas une particularité du fond génétique de la souche NOD, mais découlent de l'hyperglycémie maternelle sévère (tableau complémentaire 1) commune aux deux modèles expérimentaux.

Phénotype de protrusion de la plaque neurale chez les embryons issus de grossesses diabétiques.

(a) à (d), embryons de grossesses diabétiques de la souche NOD avec protubérances (triangles), généralement dans les emplacements caudaux. (e), embryon NOD avec une protrusion au niveau du cerveau postérieur, rostral à l'avant de la fermeture du tube neural ; vue latérale; insert : vue de la face dorsale de l'embryon. (f), embryon NOD avec deux saillies : une petite dans la région du cerveau moyen/prosencéphale et une plus grande dans la région du tronc. Insérer : sections virtuelles à travers les zones de plaques neurales non affectées (en haut) et affectées (en bas). Par rapport à la région non atteinte, la zone affectée par une protrusion présente une organisation globalement normale à l'exception d'un renflement au niveau de la ligne médiane. Ce renflement a une couche externe similaire et contiguë au neuroépithélium et un noyau où les noyaux cellulaires sont clairsemés. (g, h), les embryons de grossesses diabétiques de la souche FVB présentent des saillies similaires à celles observées dans la souche NOD. L'embryon du panneau g présente deux de ces malformations : une petite à l'extrémité caudale du cerveau postérieur potentiel et une plus grande dans la région du tronc caudal. (i – k), images dérivées de la reconstruction tridimensionnelle de données d'imagerie confocale d'embryons entiers colorés au DAPI. (i), même embryon que dans le panneau e, illustré avec une surface (violet) calculée à partir des données de volume. La saillie au niveau du cerveau postérieur est clairement discernable. (j), Deux aspects d'un plan de section parasagittal virtuel dans une présentation « à livre ouvert ». La saillie est contiguë au neuroépithélium, le noyau présentant une densité inférieure de noyaux cellulaires colorés au DAPI, rappelant le caractère mésenchymateux. (k), présentation «à livre ouvert» de l'embryon FVB illustré dans le panneau h. L'apparence morphologique des saillies est similaire chez les embryons NOD et FVB exposés au diabète.

L'imagerie par microscopie confocale à 2 photons, la reconstruction tridimensionnelle d'embryons entiers à partir de coupes optiques (Fig. 1i) et la génération ultérieure de vues à un seul plan ont permis un examen plus approfondi de la jonction entre une saillie et l'embryon (Fig. 1j, k). Nous avons détecté une contiguïté entre la saillie et la plaque neurale, la couche externe ressemblant à un neuroépithélium. Le noyau d'une saillie présentait une densité cellulaire inférieure, rappelant le caractère mésenchymateux. Cela suggère que les saillies ne sont pas exclusivement composées de cellules neuroépithéliales.

Pour déterminer l'origine des protrusions, nous avons effectué le profilage de l'expression génique sur le tissu de protrusion microdisséqué du modèle FVB, en utilisant le séquençage de l'étiquette d'expression 3'. À titre de comparaison, nous avons microdisséqué au laser le tube neural ouvert immédiatement en avant du site de fermeture 1 (Fig. Supplémentaire 2a – c). L'analyse de l'expression du gène Noto a indiqué que les échantillons de tube neural étaient exempts de notochorde potentiellement contaminante (Fig. 2d – h supplémentaire). Nous avons identifié 799 gènes avec une expression différentielle statistiquement significative dans les saillies par rapport au tube neural ouvert (Fig. 2a, Figure supplémentaire 2j) et confirmé les observations basées sur le séquençage par RT-PCR quantitative pour les gènes sélectionnés (Fig. 2b). Le regroupement hiérarchique a démontré une distinction claire des profils d'expression entre les saillies et le tube neural ouvert (Fig. 2i supplémentaire). Les annotations pour les 570 gènes avec une expression prédominante dans les saillies ont été significativement enrichies pour les termes GO "formation du mésoderme" et "développement du mésoderme".

Analyse moléculaire des protrusions de la plaque neurale.

( a ) Le profilage du transcriptome a été réalisé par séquençage d'étiquette d'expression 3' (SAGE) sur un séquenceur de nouvelle génération AB SOLiD 5500XL. Des comparaisons entre 3 saillies individuelles (n = 3) et le neuroépithélium du tube neural ouvert de 4 embryons (n = 4) ont été effectuées à l'aide de DESeq. Les données sont présentées sous la forme d'un diagramme de volcan, avec une signification statistique exprimée sous la forme -log10(padj) tracée par rapport au rapport d'expression (protrusion par rapport au tube neural). La couleur grise représente les gènes qui n'ont pas atteint la signification statistique (correction de Benjamin-Hochberg) ; gènes d'étiquettes rouges avec prévalence d'expression dans les saillies ; parmi ces gènes, la couleur bleue indique des gènes ayant un rôle connu dans le développement du mésoderme. Le vert indique les gènes à prévalence dans le tube neural ouvert, la couleur orange indiquant deux gènes d'intérêt. Les gènes où l'expression était complètement absente d'un côté du paradigme ont été tracés à un log2 de 10 ou -10. (b) Validation de la différence d'expression des gènes sélectionnés par PCR quantitative en temps réel. Huit gènes à prévalence dans les saillies (Acvr1b, Dll3, Mixl1, Nodal, Noto, T, Tbx6 et Wnt3a) ont été choisis pour validation et deux gènes (Fgfr2, Zic1) à expression prédominante dans le tube neural ouvert. Les mêmes échantillons ont été analysés à partir desquels les données de séquençage ont été dérivées ; ainsi, nous avons mesuré les niveaux d'expression génique dans quatre répliques techniques de chacune des trois saillies et dans quatre répliques techniques de chacun des 4 échantillons de neuroépithélium (provenant de 4 embryons individuels). Les barres représentent le rapport d'expression entre les saillies et le tube neural exprimé en log2. La signification statistique dans un test t est indiquée par une étoile. Les rapports d'expression obtenus à partir de l'expérience de séquençage ont été confirmés pour tous les gènes candidats, à l'exception de Nodal, qui présentait la direction attendue pour la différence d'expression, mais n'a pas atteint la signification statistique.

Pour 85 de ces gènes, des profils d'expression aux stades de Theiler 11 à 13 (qui correspondent aux jours de gestation E7.5 et E8.5) ont été rapportés précédemment (MGI, http://www.informatics.jax.org/) : 22 gènes sont connus pour être exprimés dans le neuroectoderme et le mésoderme, 33 sont limités au mésoderme, 10 sont exprimés dans le nœud et 28 gènes dans la séquence primitive (tableau supplémentaire 4). Ces résultats démontrent que les saillies contiennent du mésoderme et relient les saillies à des réseaux moléculaires actifs pendant la gastrulation : les saillies présentaient l'expression de gènes connus pour être impliqués dans la gastrulation précoce, tels que Nodal et Furin, qui est nécessaire à l'activation nodale20 et de composants impliqués dans le maintien de la séquence primitive21, tels que Fgf8, Wnt3a et T/brachyury. Nous avons également détecté des cibles de T, par exemple Cdx2, Axin2 et Lef1, ainsi que 57 gènes dans les réseaux de régulation pilotés par T 22,23, ainsi que 153 cibles en aval de Cdx222 (tableau supplémentaire 5) ; ceux-ci comprenaient des marqueurs connus du mésoderme axial, paraxial et latéral. La présence de ces réseaux de régulation indique que les cellules mésenchymateuses dans les saillies ont subi tout le programme de spécification du mésoderme actuellement connu.

Les analyses d'embryons NOD par hybridation in situ à E8.5 (Fig. 3) ont révélé des parallèles entre les saillies résultant respectivement de l'hyperglycémie maternelle spontanée et induite chimiquement. Sox2, un marqueur de la lignée épiblastique/neuronale24, était présent dans toute la couche externe de la protrusion, tandis que T, un marqueur de strie primitive et de mésoderme naissant25, était étendu dans le noyau proximal de la protrusion. Tbx6, un marqueur du mésoderme engagé24,26, a été trouvé dans la strie primitive et les cellules migrantes des ailes mésodermiques. L'expression de Tbx6 au cœur d'une saillie rappelait le développement correct du mésoderme27 : l'expression était la plus forte là où l'expression de T avait déjà été éteinte. Dans l'ensemble, ces données indiquent que la migration des cellules mésodermiques n'est pas complètement bloquée, mais altérée localement autour de la saillie.

Analyses histologiques des protrusions de la plaque neurale.

(a) Schéma d'un embryon de souris au stade 11 de Theiler (http://www.emouseatlas.org/). Les lignes noires indiquent le plan de coupe pour les sections illustrées dans les panneaux (c – e). Couleurs : violet – ectoderme et mésoderme embryonnaires ; sarcelle – amnios et allantoïde; bleu - endoderme et sac vitellin ; jaune – caduque. (b) Représentation d'un embryon de souris avec une saillie (rouge); les lignes noires indiquent une série de plans de coupe pour les sections indiquées dans les panneaux (ft) en séquence rostrale à caudale, à travers la saillie. ( c ) Coupe de la région postérieure d'un embryon issu d'une grossesse NOD normoglycémique au stade Theiler 11 après hybridation in situ avec une sonde pour Sox2. Le signal Sox2 est restreint à la couche épiblastique/ectodermique. La ligne pointillée représente la limite de l'embryon. ( d ) Section adjacente colorée avec une sonde pour T, révélant l'expression de T dans la strie primitive et le mésoderme naissant en migration. ( e ) Coupe adjacente développée avec une sonde pour Tbx6, montrant l'expression de Tbx6 dans la couche mésendodermique de la strie primitive et des ailes mésodermiques. (ft) Série de sections adjacentes à travers un embryon d'une grossesse NOD diabétique au stade de Theiler 11 présentant une saillie. Le panneau (f) montre l'aspect rostral initial de la saillie, tandis que le panneau (t) affiche la section la plus caudale de la séquence. (f,i,l,o,r), Sections sondées pour l'expression Sox2, qui est détectée dans la couche externe de la saillie. (g,j,m,p,s), sections adjacentes du même embryon révélant l'expression de T. À l'aspect rostral, T est détecté à la base de la saillie dans une région rappelant la strie primitive. Au centre de la saillie (panneau (m)), T est exprimé dans la couche externe ainsi que dans le noyau. (h,k,n,q,t). Sections adjacentes sondées pour l'expression de Tbx6. Tbx6 est détecté en évidence dans le noyau de la saillie et est absent de la couche externe. La présence de Tbx6 dans les ailes mésodermiques représente l'expression normale de ce gène dans les domaines où l'expression de T a déjà cessé.

Le mésoderme ectopique dans les saillies pourrait résulter d'une prolifération altérée de cellules mésodermiques nouvellement générées ou d'une migration désorientée du mésoderme naissant. Les analyses histologiques soutiennent la deuxième possibilité : nous n'avons pas trouvé de preuves d'une prolifération cellulaire accrue, car la coloration du marqueur de mitose Phospho-Histone 3 n'a pas révélé d'enrichissement des saillies par rapport au reste de l'embryon. Au lieu de cela, nous avons détecté un dépôt de laminine entre les cellules mésodermiques à l'intérieur et à la base d'une saillie (Fig. 4). Ceci est parallèle à l'expression prédominante de la protrusion de Laminin α5, Nidogen 2 (composants de la lame basale28,29) et Integrin α6, un récepteur pour Lama530 et est cohérent avec un rapport précédent d'expression élevée des composants de la matrice extracellulaire chez les embryons de rat exposés à des conditions d'hyperglycémie31. Ces données impliquent une adhésion cellulaire altérée ou une migration altérée des cellules mésodermiques dans la formation de saillies.

Les saillies présentent un dépôt interne de laminine.

Embryons à trois stades de développement différents, présentant des saillies : E8.0, stade de la tête (a–d) E8.5 avec plaque neurale ouverte dans la région caudale (e–h) et E9.5 avec une grande saillie interférant avec la fermeture du tube neural (i–l). Les sections ont été colorées pour l'ADN ((a,e,i); bleu, Hoechst 33342), l'histone 3 phosphorylée ((b,f,j); PH3, vert) et la laminine ((c,g,k); rouge); les images couleur fusionnées sont représentées en (d,h,l) respectivement. Abréviations : ac, cavité amniotique ; da, aorte dorsale ; fr, endoderme ; ep, couche d'épiblaste ; hf, headfold ; hg, intestin postérieur ; mw, aile mésodermique ; np, plaque neurale ; p, saillie ; donc, somatopleure ; spl, splanchnopleure. Toutes les saillies, du stade précoce au stade mature, présentent des accumulations internes de laminine dans le mésenchyme (triangles jaunes). De plus, la couche cellulaire externe est généralement séparée du mésenchyme interne par une couche de matrice extracellulaire positive à la laminine.

Les preuves d'une migration altérée provenaient de cultures d'explants (Fig. 5) dans des conditions favorables à la migration et à la différenciation du mésoderme, confirmées par la coloration de Vimentin32 (Fig. 5b, c). Dans ces cultures, la croissance des explants de tissus postérieurs d'embryons NOD exposés au diabète à E7, 5 ou à E8, 5 a été significativement réduite par rapport à la migration à partir d'explants d'embryons issus de grossesses NOD normoglycémiques (Fig. 6a). De plus, pour les embryons exposés au diabète, nous avons comparé des cultures de saillies disséquées à des explants du tissu postérieur adjacent à E8.5. Les cellules des saillies n'ont pas réussi à migrer de l'explant, ou ont migré beaucoup moins par rapport à l'excroissance observée à partir de l'expiant de tissu postérieur correspondant (comparer dans les cadres verts : Fig. 5g, h, i à j, k, l et Fig. 5 m, n, o à p, q, r, respectivement ; et Fig. 6b). La migration réduite des cellules loin des saillies ne peut pas être attribuée à l'immaturité du développement, car les cellules d'embryons antérieurs présentent une capacité migratoire comparable dans ces tests (Fig. 3a supplémentaire); l'étendue de l'excroissance n'était également pas corrélée à la taille de l'explant de départ (Fig. 3b supplémentaire). Nous concluons donc que l'exposition au diabète maternel est responsable de l'altération de la capacité migratoire du mésoderme dans les saillies. Enfin, la croissance des explants d'embryons NOD E8.5 exposés au diabète a été réduite par rapport aux explants d'embryons E8.5 exposés au diabète de la souche FVB (Fig. 6c), ce qui pourrait expliquer l'incidence plus élevée de saillies dans le modèle NOD par rapport à FVB.

Explanter des cultures de saillies et de tissu embryonnaire postérieur.

Images de cultures d'explants. Les explants fixes ont été colorés avec un anticorps contre la vimentine (vert), la phalloïdine (rouge) pour détecter l'actine et DRAQ5 (bleu) pour localiser les noyaux cellulaires. Les conditions de culture ont soutenu la migration et la différenciation du mésoderme, y compris le mésoderme cardiaque, comme en témoigne la formation de centres rythmiquement contractiles dans les explants de stries primitives d'embryons E7.5 issus de grossesses NOD normales (vidéo accélérée dans les informations supplémentaires). Les encarts identifient la zone représentée dans les images en gros plan. ( a ) L'explant d'un embryon normal E7.5 NOD avait une zone de myocytes se contractant rythmiquement (cercle orange). (b) Le même explant après coloration, en contraste sur fond noir. (c) Grossissement en gros plan de la zone d'encart. ( d - f ) Explant d'un embryon NOD E8.5 exposé au diabète. (g – l, m – r) Les explants correspondants de tissu postérieur et de protrusion du même embryon sont regroupés par un cadre vert. Par rapport au tissu postérieur du même embryon, respectivement, les saillies (g–i,m–o) présentent très peu d'excroissance (j–l,p–r).

L'exposition au diabète maternel diminue la migration cellulaire dans les cultures d'expiants.

Quantification de l'excroissance des explants en tant que distance nette vers l'extérieur migrée par les cellules à la marge de chaque explant entre les heures 6 et 26 après le début de la culture. Les astérisques marquent la signification statistique dans un test t (p < 0,05). ( a ) Les explants de tissus postérieurs d'embryons NOD exposés au diabète (exp., orange) présentent une excroissance significativement réduite par rapport aux explants de grossesses normales (n, blanches) à E7,5 (normal n = 10, exposé n = 7; p = 1,7 × 10−3; puissance de 96,7% à alpha = 0,05) et E8,5 (normal n = 8, exposé n = 39; p = 6,7 × 10−4 ; puissance de 99,7 % à alpha = 0,05). ( b ) Les explants de saillies disséquées (rouge) ont produit beaucoup moins d'excroissance que le tissu postérieur correspondant (orange) du même embryon (n = 12 paires; p = 6, 2 × 10 - 5; puissance de 99, 9% à alpha = 0, 05) à E8, 5. Notez la différence d'échelle de l'axe Y. ( c ) Les explants de tissus postérieurs d'embryons NOD E8.5 exposés au diabète (orange; mêmes données qu'en ( a ); n = 39) présentent une excroissance réduite par rapport aux explants d'embryons FVB exposés au diabète à E8.5 (violet; n = 6; p = 4, 4 × 10 - 7; puissance de 100% à alpha = 0, 05).

Ces résultats démontrent également que les conditions de culture, notamment la matrice extracellulaire de support et les facteurs de croissance présents dans le sérum de veau foetal, ne sont pas suffisantes pour pallier les déficits de migration cellulaire pendant les 26 heures de culture des explants. La culture à des concentrations de glucose plus faibles n'a eu aucun effet sur les résultats (p = 0,23 pour E7.5, p = 0,22 pour E8.5). Ainsi, les cultures d'explants confirment notre conclusion selon laquelle l'exposition in utero au diabète maternel entraîne une migration cellulaire altérée et réduit la sortie de la séquence primitive, ce qui, chez les individus les plus gravement touchés, crée des saillies à partir de la plaque neurale.

Des protrusions ont également été rapportées dans 20 modèles génétiques impliquant une perte de fonction pour les gènes Cripto (Tdgf1), Eomes, Fgf8, Fgfr1, Lrp5/Lrp6, Map4k4 (Nik), Mesp1/Mesp2, Mixl1, Pten, Rac1, Ship2, T, Talin et Tcf333,34,35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49 ou des mutations induites par ENU dans les gènes Axin2, Nckap1 (Nap1), Supt20 (p38IP) et Udgh50,51,52,53 (revu dans54). La migration du mésoderme avec facultés affaiblies a été impliquée comme base mécaniste de telles accumulations de cellules et l'ablation spécifique à l'épiblaste de Pten43 et Rac145 a identifié ces gènes comme des régulateurs cellulaires autonomes de la migration du mésoderme. Parmi 15 mutants de protrusion où les embryons survivent à des stades ultérieurs de développement, les résultats communs sont l'ouverture du tube neural ou le spina bifida (6 modèles), un développement cardiaque défectueux (9 modèles) et des défauts de croissance caudale (9 modèles)54. Contrairement aux modèles de perte de fonction dans lesquels l'expression est abolie, nous avons détecté l'expression de tous ces gènes dans les embryons exposés au diabète, Axin2, Fgf8, Mesp1, Mesp2, Mixl1 et T étant particulièrement répandus dans les saillies (Fig. 2a et Tableau supplémentaire 2), indiquant que la migration défectueuse dans nos modèles d'exposition n'est pas due à une perte d'expression génique mésodermique.

Curieusement, les saillies se sont formées à des emplacements antéro-postérieurs discrets plutôt que le long de toute la ligne primitive. Conformément aux données antérieures55, nous avons constaté que les deux tiers des MTN chez les embryons NOD (~ 26 % de tous les embryons) impliquent la région du tronc de l'embryon ; ce taux est comparable à une incidence de protrusion de 25 %, dont la quasi-totalité apparaît sur le territoire couvert par la strie primitive. Dans le modèle FVB, la moitié des MTN (~11 % de tous les embryons) impliquent le tronc (observations non publiées), un taux qui est à nouveau parallèle à l'incidence de la protrusion (12,9 %). Ainsi, dans les deux modèles de diabète, la migration défectueuse du mésoderme peut représenter la grande majorité des anomalies du tronc et du tube neural caudal dans les grossesses diabétiques chez la souris. Des saillies dans des emplacements plus antérieurs n'ont été détectées qu'occasionnellement (par exemple, Fig. 1F et insert). Même dans le territoire des stries primitives, les saillies étaient limitées à des emplacements uniques, ce qui indique peut-être une fenêtre de temps limitée pour les perturbations qui contribuent à la formation de saillies.

Il existe trois possibilités pour que les saillies provoquent des anomalies du tube neural : (i) en empêchant la formation du point charnière médian nécessaire à la flexion initiale de la plaque neurale56,57, (ii) en compromettant l'élévation et la flexion du futur neuroépithélium57 en raison de la diminution de la migration cellulaire dans le mésoderme sous-jacent et (iii) en interférant physiquement avec la fermeture du tube neural au niveau de la ligne médiane dorsale. Étant donné que ces alternatives ne sont pas mutuellement exclusives, elles nécessitent une étude plus approfondie. Des examens approfondis et des analyses histologiques d'embryons avec protrusions (Fig. 7) ont révélé des tubes neuraux correctement fermés rostral à la protrusion, avec une défaillance de neurulation caudale à la protrusion, indiquant que dans ces cas, les protubérances interféraient physiquement avec la fermeture du tube neural.

Effet des saillies sur la fermeture du tube neural.

(a) Embryon à 9,5 jours de gestation (et gros plan) montrant une saillie émergeant de sous le toit dorsal du tube neural, empêchant la fermeture vers l'extrémité caudale de l'embryon. Un dessin schématique et une analyse histologique sont représentés sur la figure supplémentaire 4. (b) Embryon à E9.5 avec une longue saillie émergeant approximativement au niveau du bourgeon des membres postérieurs, rendant la plaque neurale caudale à la saillie ouverte. ( c ) Embryon à E9.5 présentant une saillie bifurquée (les triangles roses pointent vers les extensions de la saillie) émanant du tube neural au niveau du bourgeon du membre postérieur, rendant le tube neural ouvert caudal jusqu'au point d'émergence. Le dessin schématique et l'analyse histologique sont fournis dans la figure supplémentaire 4. (d) Embryon à E10.5 (vue latérale et dorsale) avec le cerveau antérieur et le mésencéphale fermés, tandis que la neurulation a échoué caudale à la jonction mésencéphale-mésencéphale. Une petite saillie (ligne noire pointillée) peut être vue près de la jonction cerveau postérieur-moelle épinière. (e) Embryon à E10.5 avec une très petite saillie au niveau du bourgeon du membre antérieur. La neurulation a été complétée avec succès le long du neuraxis à l'exception de la petite zone de la saillie. ( f ) Embryon à E10.5 avec une saillie plus grande légèrement caudale par rapport au bourgeon du membre antérieur (triangle ouvert). Le tube neural est fermé rostral par rapport à la saillie, alors qu'il reste ouvert (triangle rempli de blanc) caudalement de la saillie jusqu'à l'extrémité du neuraxis.

Dans ce travail, nous avons identifié la migration altérée du mésoderme comme l'échec morphogénétique sous-jacent à la pathogenèse des MTN. Étant donné que ces MTN sont causées par un facteur de risque environnemental, une maladie métabolique maternelle, nos résultats impliquent que la migration du mésoderme est sensible à l'état métabolique. La migration du mésoderme semble également être sensible à la composition de l'alimentation maternelle, comme nous l'avons précédemment démontré que l'alimentation module le taux d'ATN dans le modèle FVB19. Dans la souche NOD, l'incidence des MTN est réduite par la supplémentation en acide folinique, comme indiqué ci-dessus, similaire aux effets bénéfiques de l'acide folique dans les grossesses de souris diabétiques induites par la STZ58. Ces résultats appuient la conclusion selon laquelle les facteurs métaboliques peuvent affecter la formation et la migration du mésoderme et, associés aux résultats de nos analyses moléculaires, identifient de nouvelles cibles cellulaires et moléculaires pour la prévention du tube neural et d'autres malformations congénitales.

Les malformations congénitales les plus caractéristiques des grossesses diabétiques humaines sont les malformations cardiaques, les malformations du tube neural et les anomalies de croissance caudale7,8,9,10 et ont été postulées comme survenant avant la 7e semaine de grossesse7. Nos résultats soutiennent la proposition selon laquelle la migration perturbée du mésoderme pendant la gastrulation est l'étiologie commune de ces anomalies congénitales apparemment hétérogènes59,60 : (i) des anomalies du tube neural résultent d'une migration altérée du mésoderme, comme démontré ici ; (ii) les premiers progéniteurs cardiaques proviennent et migrent de la séquence primitive61,62 ; et (iii) les défauts de croissance caudale sont également compatibles avec la formation et la migration altérées du mésoderme63,64 dans la strie primitive postérieure. De même, on pense que les déficiences mésodermiques sont à la base des malformations vertébrales, cardiaques, rénales et des membres des phénotypes VACTERL65 et dysplasie mésodermique axiale66, qui ont été liés au diabète maternel67,68,69,70. Ainsi, notre découverte de la migration aberrante du mésoderme pendant la gastrulation dans deux modèles murins différents de diabète de type I fournit un mécanisme cellulaire unificateur qui peut expliquer à la fois le moment du développement et l'origine morphogénétique des anomalies structurelles les plus courantes dans l'embryopathie diabétique.

Toutes les expérimentations animales ont été réalisées avec l'approbation préalable du Pennington Biomedical Research Center IACUC et conformément au "Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire" des National Institutes of Health des États-Unis. Les embryons ont été préparés à 8,5 jours de gestation pour une analyse histologique ou moléculaire à partir de mères NOD ou FVB hyperglycémiques, ainsi que de mères témoins normoglycémiques appariées. Les embryons présentant des malformations ont été fixés, colorés au DAPI et imagés par microscopie confocale à 2 photons. Des coupes optiques ont été utilisées pour générer des reconstructions tridimensionnelles d'embryons individuels à l'aide du logiciel Imaris. Pour déterminer l'étiologie et l'identité du tissu de protrusion, nous avons effectué le profilage de l'expression génique par séquençage d'étiquette d'expression sur un séquenceur AB SOLiD 5500XL ; les profils d'expression ont été comparés entre le tissu de protrusion et la plaque neurale ouverte préparée par microdissection laser immédiatement en avant du site de fermeture du tube neural 1. Les lectures de séquence ont été cartographiées (RefSeq RNA, mm9) à l'aide de SOLiDSAGE pour générer des données de comptage pour chaque gène. L'expression différentielle des gènes a été déterminée à l'aide de DESeq, avec validation de gènes sélectionnés par qPCR. Des hybridations in situ et des analyses immunohistochimiques ont été effectuées sur des cryosections selon des protocoles établis. La capacité migratoire des cellules dans les saillies et le tissu embryonnaire postérieur a été évaluée dans la culture d'expiants, à l'aide d'une vidéo accélérée et d'une microscopie à contraste de phase.

Codes d'accès : Les résultats SAGE ont été déposés dans la base de données Gene Expression Omnibus sous le numéro d'accès GSE53075.

Comment citer cet article : Salbaum, JM et al. Nouveau mode de fermeture défectueuse du tube neural dans la souche de souris diabétique non obèse (NOD). Sci. Rep. 5, 16917; doi : 10.1038/srep16917 (2015).

Une correction à cet article a été publiée : https://doi.org/10.1038/s41598-022-09478-1

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Le séquençage de l'ADN a été effectué par la centrale de génomique du centre de recherche biomédicale de Pennington et la microscopie confocale, l'imagerie en temps réel et la microdissection par capture laser ont été réalisées par la centrale de biologie cellulaire et de bioimagerie. Les deux installations principales sont soutenues par le PBRC Nutrition and Obesity Research Center (NORC NIH-P30DK072476) et le PBRC Center of Biomedical Research Excellence (COBRE NIH-P20GM103528). L'assistance technique experte de Richard Carmouche, Susan Newman et Diana Holmes est grandement appréciée. Ce projet a été financé par les subventions NIH R01-HD085017 et R01-HD055528, y compris le supplément HD055528-03S1 (à JMS) et R01-HD37804, y compris le supplément HD37804-S2 (à CK).

Département de régulation de l'expression génique, Pennington Biomedical Research Center, 6400 Perkins Road, Baton Rouge, 70808, LA, États-Unis

J.Michael Salbaum et Jacalyn MacGowan

Pennington Biomedical Research Center Department of Developmental Biology, 6400 Perkins Road, Baton Rouge, 70808, LA, États-Unis

Claudia Kruger, Nils J. Herion et Claudia Kappen

Pennington Biomedical Research Center Cell Biology and Bioimaging Core Facility, 6400 Perkins Road, Baton Rouge, 70808, LA, États-Unis

David Burke

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JMS et JM ont effectué des dissections d'embryons, JM a effectué des dissections au laser, C.Kr. préparé l'ARN, produit les bibliothèques SAGE et réalisé des expériences de RT-PCR et d'hybridation in situ et de coloration histologique, assistées par NH ; DB a effectué l'imagerie confocale et les reconstructions, JMS a effectué les analyses SAGE et les cultures d'explants, qui ont été quantifiées par CK ; CK et JMS ont conçu des expériences, coordonné le projet, effectué des analyses bioinformatiques et rédigé le manuscrit.

Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition.

Ce travail est sous licence internationale Creative Commons Attribution 4.0. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans la ligne de crédit ; si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons, les utilisateurs devront obtenir l'autorisation du titulaire de la licence pour reproduire le matériel. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Réimpressions et autorisations

Salbaum, J., Kruger, C., MacGowan, J. et al. Nouveau mode de fermeture défectueuse du tube neural dans la souche de souris diabétique non obèse (NOD). Sci Rep 5, 16917 (2015). https://doi.org/10.1038/srep16917

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Reçu : 13 juillet 2015

Accepté : 21 octobre 2015

Publié: 23 novembre 2015

DOI : https://doi.org/10.1038/srep16917

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