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Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 6857 (2023) Citer cet article

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Les vecteurs viraux représentent un goulot d'étranglement dans la fabrication des thérapies cellulaires. L'électroporation est apparue comme une approche pour la transfection non virale de cellules primaires, mais les approches standard à base de cuvettes souffrent d'un faible débit, d'une optimisation difficile et d'une incompatibilité avec la fabrication de cellules à grande échelle. Ici, nous présentons une nouvelle plate-forme d'électroporation capable d'une électroporation rapide et reproductible qui peut transfecter efficacement de petits volumes de cellules pour la recherche et l'optimisation des processus et s'adapter aux volumes requis pour les applications en thérapie cellulaire. Nous démontrons la livraison de l'ADN plasmidique et de l'ARNm aux cellules T humaines primaires avec une efficacité et une viabilité élevées, telles que > 95 % d'efficacité de transfection pour la livraison d'ARNm avec < 2 % de perte de viabilité cellulaire par rapport aux cellules témoins. Nous présentons des méthodes de mise à l'échelle de la livraison qui atteignent un débit expérimental de 256 millions de cellules/min. Enfin, nous démontrons une modification thérapeutiquement pertinente des lymphocytes T primaires à l'aide de CRISPR/Cas9 pour renverser l'expression du récepteur des lymphocytes T (TCR). Cette étude montre les capacités de notre système à répondre aux besoins non satisfaits d'une ingénierie efficace et non virale des cellules T pour la fabrication de cellules.

Les thérapies cellulaires ont généré de l'enthousiasme pour leur potentiel à traiter une variété de maladies héréditaires et acquises. En particulier, les immunothérapies qui utilisent des lymphocytes T autologues modifiés pour exprimer des récepteurs antigéniques chimériques (CAR) ont atteint des taux remarquables de réponse complète avec des rémissions durables et durables pour certains cancers hématologiques. La recherche s'oriente vers le traitement d'autres cancers tels que les tumeurs solides. Cependant, la première génération de thérapies cellulaires CAR-T approuvées repose sur des vecteurs viraux tels que les lentivirus ou les virus adéno-associés (AAV) pour la reprogrammation cellulaire1,2,3,4,5. Les vecteurs viraux ont permis une transduction à haute efficacité de cellules immunitaires humaines primaires difficiles à transfecter, mais présentent plusieurs inconvénients liés à leurs processus de fabrication complexes et coûteux, à leur immunogénicité et à leur potentiel de mutagenèse insertionnelle6,7,8. De plus, le domaine évolue vers des méthodes de reprogrammation plus complexes, telles que les modifications génétiques multiples via la technologie CRISPR/Cas9 et l'insertion de gènes par des éléments de transposon, qui ne sont pas compatibles avec les limites d'emballage typiques associées aux approches virales9,10,11,12,13.

Pour contourner ces limites, les efforts de recherche se sont de plus en plus concentrés sur des méthodes de transfection non virales pour remplacer l'administration virale9,14,15. Parmi les méthodes de transfection non virales, l'électroporation est une approche bien étudiée couramment utilisée pour délivrer de l'ADN, de l'ARN et des protéines dans des cellules qui est reconnue comme un concurrent majeur pour le remplacement des vecteurs viraux. Par exemple, Bozza et al. ont démontré la capacité d'utiliser l'électroporation pour générer des cellules T recombinantes à l'aide de nanovecteurs d'ADN non intégratifs qui contournent bon nombre des inconvénients associés aux approches virales8. De même, l'électroporation a récemment été utilisée pour générer des cellules CAR-T grâce à l'utilisation du système de transposon Sleeping Beauty pour le premier essai clinique avec des cellules CAR-T sans virus en Europe16 ainsi qu'avec le système piggyBac17.

Dans la méthode d'électroporation statique standard utilisée depuis de nombreuses années, un champ électrique est créé en appliquant des impulsions électriques à haute tension aux suspensions cellulaires dans une cuvette18. Les impulsions à haute tension appliquées créent des pores transitoires dans la membrane cellulaire qui permettent aux molécules de se diffuser dans les cellules19,20. Cependant, une force de champ électrique excessive peut produire une perturbation irréversible de la membrane cellulaire et la mort cellulaire. Dans le processus standard, la tension d'impulsion, le nombre d'impulsions et la durée d'impulsion font partie des paramètres variés de manière empirique pour optimiser l'efficacité de l'insertion moléculaire et de la survie cellulaire. L'optimisation empirique peut être fastidieuse et il peut y avoir une variabilité dans le processus en raison, entre autres, de l'emplacement aléatoire des cellules par rapport aux électrodes21. En outre, les méthodes d'électroporation standard de type cuvette ont un débit limité incompatible avec la fabrication de cellules à grande échelle ou automatisée22. En tant que tel, les limitations sur l'efficacité du transfert moléculaire, la viabilité cellulaire, la variabilité du processus et le débit limité ont limité l'application généralisée de cette méthode, même si les avantages potentiels par rapport à l'utilisation de vecteurs viraux sont compris.

Ici, nous décrivons une nouvelle plate-forme d'électroporation microfluidique capable d'électroporation rapide et reproductible qui peut adapter de manière transparente la livraison de la recherche à l'échelle clinique pour des applications en thérapie cellulaire. Notre approche intègre une cellule d'écoulement planaire avec une géométrie de dalle mince qui garantit que chaque cellule est soumise au même champ électrique pour une électroporation reproductible. Notamment, la largeur du dispositif dans la direction horizontale perpendiculaire au flux peut être modifiée pour correspondre au débit expérimental souhaité sans modifier le champ électrique subi par les cellules. À l'aide de notre plate-forme, nous démontrons la livraison d'ADN plasmidique et d'ARNm aux cellules T primaires à haute efficacité avec un impact minimal sur la viabilité cellulaire. En mettant à l'échelle la largeur de notre appareil et d'autres paramètres tels que le débit, nous démontrons comment les paramètres de transfection identifiés à l'aide d'une optimisation multiplexée à petit volume peuvent facilement être mis en œuvre dans les transfections à grande échelle nécessaires à la fabrication de cellules. Enfin, nous utilisons notre plateforme pour effectuer une modification thérapeutique des lymphocytes T primaires : délivrance de complexes CRISPR/Cas9 ribonucléoprotéine (RNP) ciblés contre le récepteur des lymphocytes T (TCR). Nos données démontrent le potentiel de notre système pour répondre aux besoins non satisfaits d'une ingénierie efficace et non virale des cellules T pour la fabrication de cellules.

Notre plate-forme intègre un canal microfluidique à usage unique et à flux continu capable d'une électrotransfection efficace et reproductible de cellules. Le canal microfluidique se compose d'une puce d'écoulement planaire avec une géométrie de dalle mince. Les électrodes sont modelées sur les surfaces d'écoulement supérieure et inférieure afin d'appliquer un champ électrique uniforme perpendiculaire à la direction d'écoulement (Fig. 1A). Le champ électrique est appliqué avec une forme d'onde de tension arbitraire à cycle continu. La hauteur du canal mince, 80 µm, garantit que chaque cellule est soumise au même champ électrique et environnement chimique pour permettre une électroporation reproductible. La hauteur du canal mince nous permet également d'atteindre l'intensité de champ électrique nécessaire pour ouvrir les pores de manière transitoire dans la membrane plasmique, généralement estimée entre 10 et 100 kV/m23, en utilisant des amplitudes de tension relativement faibles (environ 1 à 8 V) par rapport à la haute tension des systèmes commerciaux traditionnels. Par exemple, pour notre hauteur de canal de 80 µm, une tension appliquée de 10 V entraîne une intensité de champ électrique de 125 kV/m. Ces amplitudes de tension relativement faibles, en combinaison avec un tampon d'électroporation à faible conductivité, un débit de fluide constant et un cycle continu de la forme d'onde de tension, évitent les problèmes de formation de bulles induites par l'hydrolyse dans le canal microfluidique qui, autrement, pourraient interférer avec l'électroporation. La largeur (2 ou 10 mm) des dispositifs utilisés dans ces expériences est beaucoup plus grande que sa profondeur pour permettre un écoulement rapide et continu des cellules à travers la puce (Fig. 1B). Il est important de noter que la largeur du dispositif peut être supérieure à 10 mm et variée pour correspondre au débit expérimental souhaité sans modifier le champ électrique subi par les cellules. Ainsi, notre géométrie planaire permet de déterminer les paramètres de transfection optimaux en utilisant de petits volumes et largeurs de canaux avant de passer à de grands volumes et largeurs de canaux pour une livraison à l'échelle clinique.

Vue d'ensemble de la plate-forme d'électroporation CyteQuest. (A) Vue latérale et (B) vue de dessus schématique de la cellule d'écoulement d'électroporation (pas à l'échelle). (C) Photographie d'une cellule d'écoulement expérimentale avec des collecteurs attachés, des tubes et trois ensembles d'électrodes adressables indépendamment. (D) Schéma fonctionnel illustrant les composants qui composent la plate-forme d'électroporation. (E) Tracé illustrant une forme d'onde rectangulaire bipolaire avec une fréquence f, une durée t et une amplitude de tension, V.

Notre appareil est conçu pour s'intégrer aux approches de traitement automatisé des cellules à l'aide d'une forme d'onde de tension sélectionnable et contrôlée par ordinateur et d'une collecte de fraction robotique. Notre plate-forme est capable de fournir n'importe quelle forme d'onde électrique arbitraire. Au cours d'un fonctionnement typique, les cellules sont entraînées dans le canal par une pompe à seringue à travers une seule entrée de fluide et sortent par une seule sortie de fluide (Fig. 1C). Les cellules sont généralement suspendues dans un tampon d'électroporation à faible conductivité contenant la cargaison à livrer. Pour optimiser l'électrotransfection, un script MATLAB personnalisé contrôle un générateur de fonctions contenant des formes d'onde électriques préprogrammées tandis qu'un échantillonneur automatique robotique est programmé pour déplacer le tube de sortie pour la distribution dans une plaque multipuits (Fig. 1D). Pour changer rapidement la forme d'onde électrique appliquée aux cellules, la cellule d'écoulement est conçue avec un volume minimal (~ 11 µL) en aval des paires d'électrodes. Ce volume en aval est divisé entre la tubulure de sortie (~ 6 µL) et le canal d'écoulement (~ 5 µL). Ainsi, lorsque la forme d'onde électrique préprogrammée est permutée, les cellules sortant du tube de sortie représentent presque instantanément les cellules qui ont reçu la nouvelle forme d'onde. En chronométrant l'échantillonneur automatique robotisé pour plonger dans le puits pendant l'échange de forme d'onde, nous pouvons garantir un haut degré de pureté dans chaque puits. La période de conditions d'échantillons mixtes introduites par la transition des conditions de tension appliquées est diluée par le temps de séjour relativement long par puits (10 s) qui est un facteur 5 fois supérieur à la vitesse de permutation (~ 2 s). Ainsi, notre plateforme peut optimiser rapidement et facilement les paramètres électriques pour la transfection. Dans cette étude, nous nous concentrons sur l'utilisation de formes d'onde rectangulaires bipolaires qui peuvent être décrites par leur fréquence (f), leur durée (t) et leur amplitude de tension (V) (Fig. 1E). Dans l'ensemble, cette configuration robotique permet un balayage rapide des paramètres électriques pour sélectionner les conditions souhaitables pour la transfection. Une transfection à plus grande échelle est ensuite effectuée avec les conditions électriques sélectionnées.

Lorsque les formes d'onde sont appliquées aux cellules, le script MATLAB personnalisé contrôle également un oscilloscope pour surveiller les formes d'onde de tension. Nous mesurons le courant en mesurant la chute de tension à travers une résistance de 1 Ω en série avec la puce de flux. Des tracés représentatifs de la tension et du courant en fonction du temps dans une puce de 2 mm de large sont illustrés à la Fig. 2. Certains éléments réactifs sont présents lorsque le courant diminue légèrement sur l'intervalle de 100 µs pendant lequel la tension est appliquée. Le courant moyen est d'environ 7 mA pour une tension de 23 V. Nous calculons le champ électrique, \(\overrightarrow{E}\), dans la région entre les électrodes en utilisant la loi d'Ohm, \(\overrightarrow{J}=\sigma \overrightarrow{E}\), où \(\overrightarrow{J}\) est le courant par unité de surface (de l'électrode) et \(\sigma\) est la conductivité du tampon. En utilisant la valeur mesurée de la conductivité (9 × 10–3 S/m) et les dimensions des électrodes, on trouve un champ électrique d'environ 278 kV/m. Cela concorde bien avec une estimation simple qui suppose que les électrodes constituent une plaque parallèle séparée par un conducteur, auquel cas l'intensité du champ électrique est la tension appliquée divisée par la hauteur du canal de 80 microns. Cette estimation ne tient pas compte des effets capacitifs dus aux ions qui s'accumulent à la surface de l'électrode. Cependant, pour une tension appliquée de 23 V, ce modèle donne une estimation du champ électrique de 288 kV/m.

Traces d'oscilloscope moyennées dans le temps affichant la tension et le courant variant dans le temps mesurés par l'oscilloscope. (A) Cycles multiples du canal de tension d'une forme d'onde rectangulaire bipolaire avec f = 66 Hz, V = 23 V et t = 100 µs. La boîte en pointillés représente une région temporelle agrandie de la forme d'onde avec la tension (B) correspondante à travers le canal et le courant (C) à travers le canal. Moyenne temporelle : 64 traces.

Pour démontrer la capacité de notre plateforme à délivrer de l'ARNm, nous avons transfecté Jurkat et des lymphocytes T primaires avec de l'ARNm codant pour la GFP. Des cellules T primaires de donneurs sains ont été transfectées 4 jours après activation avec des anticorps CD3/CD28. Les deux types de cellules ont été remis en suspension à une concentration de 5 × 106 cellules/mL dans un tampon d'électroporation à faible conductivité contenant de l'ARNm codant pour la GFP à 20 µg/mL ou 40 µg/mL, chargé dans une seringue et coulé dans notre cellule d'écoulement d'électroporation comme décrit dans nos méthodes. Lorsque les cellules transitent sous l'électrode, la fréquence de la forme d'onde a été sélectionnée de telle sorte que les cellules reçoivent en moyenne trois formes d'onde rectangulaires bipolaires (Fig. 1E) pendant leur temps de transit à travers le champ électrique (t = 100 µs, f = 100 Hz). Cette valeur a été déduite de la vitesse linéaire moyenne, du débit volumétrique et de la dimension de l'électrode dans le sens de l'écoulement. Comme témoin, les cellules ont été recueillies à une tension appliquée nulle.

Pour mesurer les performances de livraison, les cellules ont été analysées 24 h après la transfection par cytométrie en flux (Fig. 3A, B). Pour chaque condition de tension, le nombre de cellules, la viabilité et l'expression de la GFP ont été directement mesurés par déclenchement successif comme décrit dans les méthodes. La viabilité pour chaque condition de tension a été calculée comme le nombre de cellules viables (Nviable), mesuré à l'aide d'un colorant de viabilité (7-AAD), divisé par le nombre total de cellules dans cette condition de tension, mesuré 24 h après la transfection (Ntotal).

Livraison de l'ARNm codant pour la GFP aux cellules Jurkat et T primaires. (A) Parcelles de cytométrie en flux représentatives à partir de cellules Jurkat à tension nulle ou (B) électroporées illustrant la morphologie cellulaire, la viabilité et l'expression de la GFP. (C) Impact de l'amplitude variable de la tension de forme d'onde sur la livraison à l'aide de 20 ou 40 µg/mL d'ARNm aux cellules Jurkat (n = 3). (D) Livraison à haut rendement à l'aide de 40 µg/mL d'ARNm pour les lymphocytes T primaires de quatre donneurs sains (n ​​= 4). Données présentées sous forme de moyenne ± écart type (C, D). Certaines barres d'erreur sont trop petites pour être visibles (C).

Pour les lymphocytes T primaires, un rapport de viabilité a été calculé car la viabilité initiale de chaque donneur de lymphocytes T variait de 83 à 92 %, indépendamment de l'électroporation. Le rapport de viabilité a été calculé comme la viabilité (Eq. 1) divisée par la viabilité des cellules de contrôle à tension nulle (contrôle Viabilityzero-voltage).

La viabilité des cellules de contrôle à tension nulle est mesurée 24 h après la transfection à partir de cellules qui ont traversé l'appareil sans champ électrique appliqué. L'expression de la GFP a été définie comme le nombre de cellules viables et exprimant (Nexpressing) divisé par le nombre de cellules viables.

Étant donné que notre mesure de la viabilité ne tient pas compte des cellules qui ont été perdues pendant l'électroporation (c'est-à-dire la lyse complète), nous avons également calculé le rendement relatif comme le nombre total de cellules dans chaque condition de tension (Ntotal) divisé par le nombre de cellules de contrôle à tension nulle (contrôle Nzero-voltage).

Étant donné que le rendement relatif est mesuré à partir du nombre de cellules 24 h après la transfection, cette mesure est influencée par la variation de l'ensemencement cellulaire, la variation du taux de prolifération et la lyse ou la perte cellulaire pendant l'électroporation.

Nous avons testé l'administration d'ARNm aux cellules Jurkat en utilisant 20 ou 40 µg/mL d'ARNm codant pour la GFP et une amplitude de tension de forme d'onde allant de 3 à 11 V (Fig. 3C). Au fur et à mesure que l'amplitude de la tension de la forme d'onde augmentait, nous avons observé un effet de seuil dans lequel l'expression de la GFP était absente en dessous de 5 V, puis augmentait jusqu'à atteindre une valeur de plateau d'environ 97 % à 11 V. À toutes les amplitudes de tension et concentrations d'ARNm testées, la viabilité est restée inchangée par rapport aux contrôles à tension nulle tandis que le rendement relatif est resté > 90 % (Fig. 3C, Figure S1A). Notamment, nous avons observé une expression de GFP de 95 % ± 1,8 % à partir de cellules T primaires dérivées de quatre donneurs sains, tandis que le rapport de viabilité et le rendement relatif étaient de 98 % ± 1,4 % et 92 % ± 6,6 %, respectivement (Fig. 3D, Figure S1B). Des images microscopiques représentatives de lymphocytes T primaires exprimant l'ARNm codant pour la GFP sont présentées à la figure S2. En tant que telles, ces données démontrent la capacité de notre plate-forme à fournir de l'ARNm à haute efficacité sans impact sur la viabilité cellulaire.

À titre de comparaison avec notre système microfluidique, nous avons transfecté des lymphocytes T primaires avec de l'ARNm codant pour la GFP (40 µg/mL) à l'aide d'un système d'électroporation à cuvette, le Gene Pulser de Bio-Rad. Les cellules T primaires ont été cultivées et préparées de la même manière que notre système, sauf que les cellules ont été suspendues dans un tampon d'électroporation Gene Pulser plutôt que dans un tampon à faible conductivité. Nous avons observé une expression de GFP de 83 ± 9 % avec un taux de viabilité de 91 ± 10 % (Figure supplémentaire S3). Celles-ci sont similaires aux valeurs rapportées par Bio-Rad, qui rapporte un maximum d'expression de GFP de 81% et une viabilité de 91% à partir de cellules T primaires transfectées avec la même construction d'ARNm (1). Étant donné que notre plate-forme fournit des valeurs plus élevées pour l'expression et la viabilité de la GFP, ces résultats démontrent comment notre plate-forme surpasse le système de cuvette Gene Pulser pour la livraison d'ARNm.

Étant donné que les thérapies cellulaires autologues actuelles nécessitent de grands volumes de cellules modifiées24, nous avons examiné trois méthodes facilement disponibles avec notre plate-forme pour augmenter le débit de traitement cellulaire : (1) augmenter proportionnellement la largeur et le débit volumétrique du canal d'écoulement, (2) augmenter proportionnellement le débit de fluide et la fréquence de la forme d'onde, et (3) augmenter la concentration cellulaire dans le tampon d'électroporation.

L'augmentation du débit volumétrique et de la largeur du canal par le même facteur laisse la vitesse d'écoulement linéaire moyenne des cellules sous l'électrode inchangée et n'a donc pas d'impact sur l'environnement électrique ou chimique des cellules. Nous avons augmenté la largeur du canal de 2 mm, utilisé dans notre étude d'optimisation, à 10 mm tout en augmentant proportionnellement le débit volumétrique de 320 µL/min à 1,6 mL/min (Fig. 4A,B). Les cellules Jurkat ont été électroporées avec de l'ARNm codant pour la GFP (20 µg/mL) dans les deux canaux en utilisant une forme d'onde rectangulaire bipolaire (t = 100 µs, f = 100 Hz, V = 13 V) à une concentration de 5 × 106 cellules/mL comme décrit précédemment. Notamment, l'expression, la viabilité et le rendement relatif de la GFP étaient à peu près identiques dans les canaux de 2 et 10 mm, tandis que le débit de traitement cellulaire augmentait d'un facteur cinq, passant de 1, 6 × 106 à 8 × 106 cellules / min (Fig. 4C, Figure S4A). Ces résultats indiquent que l'augmentation proportionnelle de la largeur du canal de la cellule d'écoulement et du débit volumétrique présente une méthode simple pour augmenter de manière transparente le débit de traitement des cellules.

Augmentation du débit de traitement cellulaire pour des volumes à l'échelle clinique. (A) Photographie d'une cellule d'écoulement d'électroporation de 2 mm et (B) de 10 mm. Les flèches rouges mettent en évidence la largeur du canal. (C) Parcelle des valeurs d'expression et de viabilité de la GFP à partir de cellules Jurkat transfectées avec de l'ARNm codant pour la GFP dans les canaux de 2 ou 10 mm (n = 3). (D) Parcelle des valeurs d'expression et de viabilité de la GFP à partir de cellules Jurkat transfectées avec de l'ARNm codant pour la GFP dans le canal de 2 mm à différentes concentrations de cellules dans le tampon d'électroporation (n = 3). (E) Parcelle des valeurs d'expression et de viabilité de la GFP à partir de cellules Jurkat transfectées avec de l'ARNm codant pour la GFP dans le canal de 10 mm à différents débits et fréquences de forme d'onde (n = 3). (F) Parcelle de l'expression et de la viabilité de la GFP dans le temps à partir d'une expérience qui a transfecté ~ 240 millions de cellules sur 56 s (n = 1). Données présentées sous forme de moyenne ± écart type (C–E). Certaines barres d'erreur sont trop petites pour être visibles (C–E).

Nous avons testé l'augmentation de la concentration de cellules dans le tampon d'électroporation comme méthode pour augmenter le débit de traitement des cellules. Les cellules Jurkat ont été électroporées avec de l'ARNm codant pour la GFP (20 µg/mL) en utilisant une forme d'onde rectangulaire bipolaire (t = 100 µs, V = 13 V, f = 100 Hz) comme décrit précédemment. Nous avons testé des cellules transfectantes à une concentration de 5, 10 ou 20 × 106 cellules/mL et n'avons observé aucune différence dans l'expression, la viabilité ou le rendement relatif de la GFP (Fig. 4D, Figure S4B). En tant que tel, l'augmentation de la concentration cellulaire pendant la transfection offre une autre méthode simple pour améliorer le débit de traitement cellulaire.

En plus d'augmenter la largeur du canal ou la concentration cellulaire, nous avons également augmenté proportionnellement le débit volumétrique et la fréquence de la forme d'onde électrique pour augmenter le débit. Les cellules Jurkat ont été électroporées avec de l'ARNm codant pour la GFP (20 µg/mL) en utilisant une forme d'onde rectangulaire bipolaire (t = 100 µs, V = 13 V) à une concentration de 5 × 106 cellules/mL comme décrit précédemment. Nous avons testé l'augmentation de la fréquence de la forme d'onde de 100 à 800 Hz avec une augmentation proportionnelle du débit volumétrique de 1,6 à 12,8 mL/min. Nous n'avons observé aucune différence dans l'expression, la viabilité ou le rendement relatif de la GFP (Fig. 4E, Figure S4C). Il est important de noter que l'augmentation proportionnelle de la fréquence de la forme d'onde et du débit a augmenté le débit cellulaire de 8 × 106 à 64 × 106 cellules/min. En tant que telle, cette méthode peut augmenter considérablement le débit de traitement des cellules sans modifier la géométrie du canal d'écoulement.

Enfin, nous avons combiné toutes les méthodes susmentionnées pour augmenter le débit de traitement cellulaire dans une seule expérience afin de délivrer efficacement l'ARNm codant pour la GFP à environ 240 millions de cellules Jurkat dans une démonstration d'une transfection à l'échelle clinique. Les cellules Jurkat ont été transfectées avec de l'ARNm (20 µg/mL) en utilisant une forme d'onde rectangulaire bipolaire (t = 100 µs, V = 13 V, f = 800 Hz) à une concentration de 20 × 106 cellules/mL tout en s'écoulant à 12,8 mL/min. À une vitesse de traitement de 256 millions de cellules/min, la livraison à 240 millions de cellules a pris environ 56 s. Nous avons échantillonné des cellules à différents moments de l'accouchement et avons constaté que l'expression et la viabilité de la GFP étaient cohérentes dans le temps à 97 ± 0, 12% et 96 ± 0, 39%, respectivement (Fig. 4F). Le rendement relatif était plus variable à 73 % ± 5 %. Dans l'ensemble, la variété des méthodes disponibles sur notre plate-forme pour augmenter le débit de traitement des cellules fournit une livraison très efficace aux vitesses requises pour une livraison à l'échelle clinique.

Pour démontrer la livraison de l'ADN plasmidique, nous avons utilisé des formes d'onde rectangulaires bipolaires avec une durée fixe (t = 100 µs) et testé l'impact de la variation de trois paramètres avec les cellules Jurkat et pan T primaires : amplitude de tension de forme d'onde (V), fréquence de forme d'onde (f) et concentration de plasmide.

Les cellules Jurkat et pan T primaires ont été préparées comme décrit précédemment. Pour les cellules Jurkat et T primaires, l'augmentation de la concentration d'ADN plasmidique codant pour la GFP a entraîné une expression accrue de la GFP, une diminution de la viabilité et une diminution du rendement relatif (Fig. 5A, C, Figure S5A, B). Des images microscopiques représentatives de lymphocytes T primaires exprimant l'ADN plasmidique codant pour la GFP sont présentées à la figure S6. Fait intéressant, l'augmentation de la concentration de plasmide avait des rendements décroissants avec des gains plus faibles dans l'expression de GFP à mesure que la concentration de plasmide augmentait. De même, l'augmentation de la fréquence de la forme d'onde a également augmenté l'expression de GFP avec des rendements décroissants significatifs tout en diminuant la viabilité et le rendement relatif (Fig. 5B, D, Figure S5C, D). Nous avons testé trois valeurs de fréquence de forme d'onde qui correspondent à des cellules recevant en moyenne 1 (33 Hz), 2 (66 Hz) ou 3 (100 Hz) formes d'onde par temps de transit sous l'électrode. Le débit volumétrique a été maintenu constant dans tous les cas. En général, il y avait une forte augmentation de l'expression de la GFP de 33 à 66 Hz avec presque aucune autre augmentation de 66 à 100 Hz. Les cellules Jurkat ont présenté des performances reproductibles sur trois expériences indépendantes avec des valeurs d'écart type allant de 1 à 4 % pour l'expression de la GFP et de 1 à 5 % pour la viabilité. Les lymphocytes T primaires présentaient une variation significative de donneur à donneur (figures S7, S8). Dans l'ensemble, en faisant varier trois paramètres, nous avons pu ajuster l'expression et la viabilité des plasmides dans une large gamme de valeurs pour les deux types de cellules.

Résultats pour divers paramètres de transfection pour la livraison d'ADN plasmidique codant pour la GFP à Jurkat et aux lymphocytes T primaires. (A) Impact de la variation de la concentration de plasmide ou de la fréquence de la forme d'onde (B) pour la livraison de l'ADN plasmidique aux cellules Jurkat. (C) Impact de la variation de la concentration de plasmide ou de la fréquence de la forme d'onde (D) pour la livraison de l'ADN plasmidique aux lymphocytes T primaires. Données affichées sous forme de moyenne ± écart type ; n = 3 (A, B). Données présentées sous forme de valeurs provenant d'un donneur représentatif ; n = 1 (C, D). Certaines barres d'erreur sont trop petites pour être visibles pour les cellules Jurkat (A, B).

À titre de comparaison avec notre système microfluidique, nous avons transfecté des cellules T primaires avec de l'ADN plasmidique codant pour la GFP (75 µg/mL) à l'aide du système de cuvette Gene Pulser. Les lymphocytes T primaires transfectés dans le Gene Pulser avec de l'ADN plasmidique présentaient une expression de GFP de 62 ± 15 % et un taux de viabilité de 70 ± 19 % (Figure supplémentaire S3). Dans notre système, pour les conditions de livraison les plus similaires, nous rapportons une expression de GFP de 65 ± 7 % et un taux de viabilité de 70 ± 9 % (f = 33 Hz, V = 29 V, t = 100 µs). Des valeurs moyennes similaires pour l'expression de GFP et le rapport de viabilité suggèrent des performances similaires pour la livraison d'ADN plasmidique. Cependant, notre plate-forme microfluidique fournit des valeurs inférieures pour l'écart type, ce qui est probablement dû au champ électrique uniforme inhérent à la géométrie de la dalle mince de notre puce d'écoulement. Des valeurs d'écart type inférieures pour l'expression et la viabilité de la GFP offrent un avantage distinct à notre plate-forme microfluidique.

Pour démontrer la flexibilité de notre plate-forme, nous avons fourni de l'ADN plasmidique codant pour la GFP aux cellules Jurkat en utilisant une forme d'onde arbitraire. Nous avons sélectionné une forme d'onde à double niveau caractérisée par un segment de courte durée et de grande amplitude (V1, t1) censé nucléer les pores, suivi d'un segment de plus longue durée et de faible amplitude (V2, t2) censé faire croître les pores et entraîner par électrophorèse une cargaison chargée, telle que l'ADN, dans la cellule25,26 (Fig. 6A). Des formes d'onde à double niveau ont été trouvées par certains groupes pour équilibrer favorablement l'expression d'ADN plasmidique avec la viabilité cellulaire. Motivés par ces rapports, et comme démonstration des capacités de notre système, nous avons sélectionné f = 66 Hz, V1 = 21 V et t1 = 75 µs et mesuré l'impact de la variation de V2 ou t2 du segment de plus longue durée et de faible amplitude (Fig. 6A).

Livraison d'une forme d'onde électrique arbitraire. (A) Tracé illustrant une forme d'onde bipolaire à double tension caractérisée par un segment de courte durée et de haute amplitude (V1, t1) suivi d'un segment de longue durée et de faible amplitude (V2, t2) (B) Impact de la variation de V2 pendant que t2 = 250 µs (n = 3). (C) Impact de la variation de t2 alors que V2 = 4 V (n = 3). Dans (B) et (C), nous fixons f = 66 Hz, V1 = 21 V et t1 = 75 µs. Données présentées sous forme de moyenne ± écart type (B, C). Certaines barres d'erreur sont trop petites pour être visibles (B,C).

Les cellules Jurkat ont été préparées comme décrit précédemment. L'efficacité de la transfection a été définie comme le produit de l'expression et de la viabilité de la GFP et calculée comme une seule métrique pour comparer les performances de la forme d'onde. Au fur et à mesure que V2 ou t2 augmentaient, l'expression de la GFP augmentait tandis que la viabilité et le rendement relatif diminuaient (Fig. 6B, C, Figure S9). Notamment, notre métrique pour les performances de la forme d'onde, l'efficacité, a présenté une valeur maximale à des valeurs intermédiaires de V2, illustrant comment une forme d'onde à double niveau de tension peut équilibrer favorablement l'expression et la viabilité de la GFP. Dans l'ensemble, ces données démontrent les capacités de notre plate-forme à fournir une forme d'onde de tension arbitraire et comment cette capacité pourrait offrir des avantages pour améliorer les performances d'électroporation de l'ADN plasmidique.

Pour démontrer nos capacités à livrer du fret au-delà de GFP, nous nous sommes ensuite tournés vers le système CRISPR-Cas9. Nous avons choisi de cibler les locus TRAC et TRBC, qui codent pour les chaînes alpha et bêta du TCR, car l'élimination de l'expression du TCR est étudiée comme méthode d'évitement de la maladie du greffon contre l'hôte (GVHD) pour l'ingénierie des cellules CAR T allogéniques14. Des cellules T primaires de donneurs sains ont été transfectées 4 jours après l'activation avec des anticorps CD3/CD28 en utilisant des formes d'onde rectangulaires bipolaires (t = 100 µs, f = 100 Hz, V = 5–29 V) et en utilisant des RNP CRISPR–Cas9 (1 µM). L'expression du TCR, le rapport de viabilité et le rendement relatif ont été mesurés 72 h après la transfection à l'aide d'un anticorps anti-TCR humain et d'une cytométrie en flux. Au fur et à mesure que l'amplitude de la tension de la forme d'onde augmentait, l'expression du TCR chutait précipitamment de 89 ± 1,0 % à 7,4 ± 1,0 % (Fig. 7). Le rapport de viabilité a également diminué avec l'augmentation de la tension avec des changements minimes jusqu'à 25 V, ce qui a donné une expression de TCR de 12 ± 2, 1% et un rapport de viabilité de 88 ± 1, 0%. Après 25 V, le taux de viabilité chute fortement. Ensuite, nous avons mesuré la capacité proliférative des cellules témoins (0 V) et électroporées (25 V et 29 V) sur une période de 7 jours après la transfection (Figure S10). Les lymphocytes T témoins à tension zéro se sont développés rapidement, subissant de multiples doublements de population au cours de la période d'observation de 7 jours. Les cellules T électroporées avec la forme d'onde de 25 V ont présenté un taux de prolifération inférieur pendant 2 jours après l'électroporation par rapport aux cellules témoins. Après cette période de récupération, les cellules qui ont reçu la forme d'onde de 25 V ont proliféré à un rythme identique aux cellules témoins. Les cellules T qui ont reçu une amplitude de forme d'onde plus élevée ont montré une capacité de prolifération moindre. Ces résultats illustrent le compromis entre des efficacités de transfection très élevées et la santé cellulaire. Dans l'ensemble, ces données suggèrent que notre plateforme a la capacité d'effectuer le génie génétique CRISPR/Cas9, une technique prometteuse pour faire progresser les thérapies cellulaires au-delà des thérapies cellulaires autologues actuellement approuvées.

Livraison de CRISPR/Cas9 RNP ciblant TRAC/TRBC. Graphique de l'expression du TCR, du rapport de viabilité ou du rendement relatif en fonction de l'amplitude de la tension appliquée, mesuré 72 h après la transfection des cellules T primaires avec les RNP CRISPR/Cas9 ciblant TRAC/TRBC (n = 3). Données présentées sous forme de moyenne ± écart type. Certaines barres d'erreur sont trop petites pour être visibles.

L'électroporation représente une approche prometteuse pour remplacer les méthodes basées sur les virus pour fabriquer des thérapies cellulaires, mais les méthodes traditionnelles de type cuvette restent limitées par la variabilité des processus, l'optimisation difficile et le faible débit. Ici, nous présentons une nouvelle plate-forme d'électroporation qui contourne ces limitations grâce à l'incorporation d'une cellule d'écoulement planaire couplée à une expérimentation automatisée. Comme le démontrent nos données de performance, nous pouvons explorer rapidement un grand espace de paramètres pour dériver les conditions d'une livraison efficace de différentes cargaisons moléculaires aux cellules. Fait important, nous avons également démontré comment les optimisations effectuées à l'aide de petits volumes peuvent être directement traduites en transfections à grande échelle pour la fabrication de cellules. Ensemble, ces innovations démontrent le potentiel de notre plateforme pour répondre aux besoins non satisfaits en matière d'ingénierie non virale des lymphocytes T pour la fabrication de cellules.

Nous avons observé une livraison à haut rendement d'ARNm codant pour la GFP à Jurkat et aux lymphocytes T primaires (> 98 % pour Jurkat, > 95 % de lymphocytes T primaires) sans impact significatif sur la viabilité cellulaire ou le rendement relatif de notre appareil. Nos performances de livraison d'ARNm dépassent les valeurs rapportées par les dispositifs d'électroporation de type cuvette et respectent ou dépassent les mesures de performance d'autres approches de transfection microfluidiques non virales27,28,29,30. Pour nos comparaisons avec d'autres approches, y compris nos transfections à l'aide du système Gene Pulser, il est important de noter que les conditions expérimentales peuvent modifier considérablement les performances de transfection, y compris la préparation cellulaire, les concentrations de cellules et/ou de cargaison et le choix du tampon d'électroporation. Surtout, nous avons pu mettre à l'échelle de manière transparente la livraison d'ARNm en augmentant la concentration de cellules dans le tampon d'électroporation, la largeur du canal, le débit et la fréquence de la forme d'onde. La combinaison de ces méthodes de mise à l'échelle nous a permis d'augmenter le débit jusqu'à 256 millions de cellules/min en utilisant une largeur de canal de 10 mm, une largeur qui peut être encore élargie. Dans l'ensemble, nos résultats indiquent qu'en augmentant la largeur de notre canal et en utilisant des conditions de flux, chimiques et électriques démontrées, nous pouvons répondre aux quantités de cellules requises pour les thérapies cellulaires qui nécessitent souvent plus d'un milliard de cellules14,34,35.

Les thérapies actuelles par lymphocytes T autologues nécessitent une fabrication longue et coûteuse qui limite leur utilisation clinique à grande échelle14. Les cellules CAR-T universelles "sur étagère" ou allogéniques provenant de donneurs sains pourraient contourner ces limitations, mais les cellules CAR-T allogéniques peuvent être rapidement éliminées par le système immunitaire de l'hôte et peuvent également provoquer une maladie du greffon contre l'hôte (GVHD) potentiellement mortelle35,36. La perturbation des gènes codant pour le TCR-α (TRAC) et le TCR-β (TRBC) a été rapportée ailleurs comme méthode pour réduire le risque de GVHD et est actuellement étudiée dans des études précliniques et des essais cliniques36,37,38,39. Ici, nous démontrons la livraison de RNP CRISPR-Cas9 pour inhiber efficacement l'expression primaire des lymphocytes T du TCR afin de montrer comment notre dispositif pourrait être utilisé pour la fabrication de cellules CAR-T allogéniques de nouvelle génération.

La géométrie de la dalle mince et les électrodes à plaques parallèles de notre Flow Cell sont l'innovation qui fournit de nombreux points forts de notre plate-forme, notamment (1) la capacité de soumettre chaque cellule au même champ électrique et (2) la capacité de s'adapter à n'importe quel débit souhaité avec un minimum d'effort. Ces innovations distinguent notre approche des autres approches pour développer des dispositifs de transfection microfluidiques non viraux. La hauteur du canal mince (80 µm) crée une géométrie de plaque parallèle avec un champ électrique spatialement uniforme qui donne une électroporation hautement reproductible. Nous rapportons des écarts-types pour l'expression et la viabilité de la GFP régulièrement inférieurs à 5 %. De plus, la hauteur du canal mince nous permet d'atteindre l'intensité de champ électrique nécessaire, généralement autour de 10 à 100 kV/m, pour l'électroporation avec une amplitude de tension relativement faible (environ 1 à 8 V) par rapport aux systèmes commerciaux traditionnels ou à certains autres dispositifs d'électroporation microfluidique28. Par exemple, nous avons observé que l'expression de l'ARNm commençait à une amplitude de tension de 5 V et plafonnait autour de 11 V. Ainsi, notre appareil peut éviter l'utilisation de hautes tensions. Notre dispositif intègre également un système d'écoulement fluidique simple et unique qui contraste avec des approches plus complexes telles que le système à flux multiples utilisé par Lissandrello et al.28.

L'architecture planaire de la puce d'écoulement, avec le rapport de la dimension étroite à large perpendiculaire à l'écoulement étant inférieur à 10 %, joue un rôle important dans la capacité d'augmenter la largeur et le débit sans affecter l'environnement électrique des cellules. Dans un dispositif microfluidique à section circulaire, ou dans lequel la radio de la largeur à la hauteur est d'environ 1, la vitesse du fluide a une forme parabolique à travers le canal avec un maximum en son centre. Comme discuté dans Brody et al., le profil de vitesse dans un canal rectangulaire devient « en forme de bouchon » le long de la dimension large lorsque le rapport de la dimension étroite à la dimension large est inférieur à 10 %40. Ce profil en forme de bouchon est constant jusqu'à ce qu'il passe à une vitesse nulle aux bords sur une distance comparable à la hauteur du canal. Ce profil de vitesse en forme de bouchon est une caractéristique bien connue de ce que l'on appelle l'écoulement Hele-Shaw dans une cellule d'écoulement rectangulaire avec un petit rapport d'aspect étroit à large. Cela implique que le temps pendant lequel une cellule est soumise à un champ électrique dans la cellule d'écoulement que nous décrivons est essentiellement constant pour toute position le long de la largeur de la cellule d'écoulement (sauf près des bords comme détaillé). Si l'on augmente le débit dudit dispositif en augmentant proportionnellement la largeur et le débit volumétrique, cette caractéristique reste valable. Le profil de vitesse d'écoulement dans la direction verticale est parabolique. Cependant, étant donné que la taille des cellules est une fraction non négligeable de la hauteur du canal, la dispersion de la vitesse d'écoulement dans la direction verticale est inférieure à ce que serait la dispersion de petites particules. Il est important de noter que le profil parabolique de la vitesse d'écoulement dans la direction verticale n'a pas d'incidence sur notre capacité à adapter le débit en augmentant proportionnellement la largeur et le débit volumétrique en raison de l'écoulement Hele-Shaw mentionné précédemment dans la dimension large. Ainsi, les paramètres d'électroporation optimisés dans un dispositif à faible échantillon sont inchangés dans un tel dispositif avec une largeur et un débit accrus.

Ici, nous avons démontré notre fonctionnalité de mise à l'échelle en comparant les performances de transfection entre deux cellules d'écoulement différentes avec différentes largeurs de canal : un canal de 2 mm et un canal de 10 mm. L'augmentation de la largeur du canal et du débit par un facteur de cinq a augmenté le débit expérimental par un facteur de cinq avec des performances identiques en utilisant une forme d'onde électrique identique. Cette capacité à déterminer les paramètres de transfection à l'aide de petits volumes de cellules et de réactifs et à traduire directement des paramètres optimisés pour une livraison à grande échelle à l'échelle clinique est un avantage clé de notre plateforme. Notamment, bien qu'il existe plusieurs autres plates-formes à flux continu capables de transfection non virale de cellules T primaires, aucune n'offre la capacité de mise à l'échelle transparente inhérente à notre géométrie de dalle mince à largeur variable. Par exemple, les approches de mécanoporation réalisent la livraison par des constrictions physiques qui ouvrent temporairement la membrane plasmique41,42. Cependant, la mise à l'échelle nécessite une parallélisation car le débit et les dimensions du canal influencent les paramètres de transfection.

Bien que de nombreux groupes développent des approches microfluidiques non virales qui démontrent la livraison de cargaison d'ARNm aux cellules T primaires, il existe relativement peu de données sur leur performance en utilisant l'ADN plasmidique28,29,30. Ici, nous démontrons la livraison efficace d'ADN plasmidique aux cellules Jurkat et T primaires. Par rapport à la livraison d'ARNm, la livraison efficace de l'ADN plasmidique codant pour la GFP a nécessité environ le double de l'intensité du champ électrique et a donné une efficacité de transfection, une viabilité et des valeurs de rendement relatives inférieures. Il existe probablement plusieurs explications à la difficulté de délivrer l'ADN plasmidique, et les mécanismes de transport exacts pour l'électrotransfert d'ADN ne sont pas encore bien compris43,44. La relative facilité de livraison de l'ARNm est probablement influencée par la nécessité pour l'ADN d'entrer dans le noyau pour l'expression et par la taille relativement petite de notre cargaison d'ARNm (~ 1 kB) par rapport à notre cargaison d'ADN plasmidique (~ 3,7 kB). L'augmentation de la taille du plasmide a déjà été signalée comme ayant un impact négatif sur l'efficacité et la viabilité de la transfection45. De plus, l'ADN plasmidique a des modèles moléculaires associés aux agents pathogènes, tels que des motifs CpG non méthylés, qui peuvent déclencher l'apoptose46. La cytotoxicité associée aux motifs CpG pourrait expliquer notre observation selon laquelle l'augmentation de la concentration d'ADN plasmidique a diminué la viabilité cellulaire indépendamment des paramètres de forme d'onde électrique. Au fur et à mesure que la concentration d'ADN plasmidique augmentait dans le tampon d'électroporation, nous avons observé une expression GFP plus brillante (données non présentées) suggérant une augmentation de l'électrotransfert plasmidique qui pourrait également expliquer une diminution de la viabilité cellulaire indépendante des paramètres de forme d'onde électrique. Pour délivrer efficacement l'ADN plasmidique aux cellules T, les plates-formes de nanovecteurs d'ADN sont une possibilité de réduire la taille du plasmide en supprimant les séquences d'ADN inutiles tout en appauvrissant également les séquences CpG dans le vecteur pour réduire la toxicité en supprimant un motif moléculaire associé à un pathogène8,46.

La possibilité de fournir un champ électrique variable dans le temps arbitraire fournit un espace de paramètres presque illimité pour optimiser les performances. Nous avons utilisé des formes d'onde bipolaires pour limiter l'effet des réactions électrochimiques qui se produisent à l'électrode et limiter l'accumulation de charge aux électrodes. La flexibilité dans la conception de la forme d'onde offre la possibilité d'adapter la livraison à la cargaison particulière. Par exemple, il existe des preuves que le transfert électrophorétique contribue à la livraison d'ADN plasmidique et a conduit à l'émergence de formes d'onde à double tension pour améliorer les performances de livraison23,25,26,47. En effet, nous démontrons qu'une forme d'onde à double tension peut améliorer l'efficacité de la livraison de l'ADN plasmidique aux cellules Jurkat. Nous avons également évalué l'impact de la variation de l'amplitude de la forme d'onde de tension ainsi que de la fréquence de la forme d'onde et donc du nombre de cycles de forme d'onde subis par les cellules en circulation. La concentration de plasmide, les concentrations de cellules et d'autres paramètres de processus ont également été modifiées. L'augmentation de la concentration de cargaison ou l'augmentation de l'amplitude de la forme d'onde de tension avait tendance à augmenter l'efficacité de la transfection et à réduire la viabilité. Ces résultats sont cohérents avec de nombreuses études antérieures qui documentent le compromis entre l'efficacité de transfection de l'ADN plasmidique et la viabilité48,49.

En résumé, nos résultats démontrent les capacités de notre nouvelle plate-forme d'électroporation pour une livraison à haute efficacité et haute viabilité de plusieurs cargaisons à Jurkat et aux cellules T primaires. Les innovations apportées par notre plateforme microfluidique et ses performances supérieures en font un système prometteur de reprogrammation cellulaire non virale pour les thérapies cellulaires.

Les puces à flux d'électroporation ont été construites à partir d'un empilement à trois couches de substrats polymères. Les trois couches ont été découpées au laser avec un petit faisceau laser CO2 haute résolution. Les couches supérieure et inférieure, découpées dans des dalles acryliques de 1 mm d'épaisseur (McMaster Carr, Robbinsville, NJ, États-Unis), créent les surfaces du sol et des canaux d'étanchéité. La couche intermédiaire était une entretoise qui définissait la profondeur et la largeur du canal et était composée d'un mince ruban adhésif hydrophile sensible à la pression. L'hydrophilie de l'entretoise a attiré des solutions aqueuses pour annuler le piégeage de l'air lors du remplissage du canal microfluidique. Pour fabriquer la puce, les couches acryliques inférieure et supérieure ont été découpées au laser en morceaux de 1″ × 2″. Les pièces ont ensuite été découpées au laser pour ajouter des orifices d'entrée/sortie de fluide et des trous d'alignement à utiliser pendant le processus d'assemblage. Chaque pièce acrylique a été nettoyée avec de l'eau puis de l'alcool isopropylique. Ensuite, une fine couche d'adhérence en titane et une électrode à couche mince d'or ont été déposées par dépôt physique en phase vapeur à l'aide d'un système d'évaporation à canon à électrons CVC SC4500 sur la surface intérieure de chaque pièce acrylique à la Cornell NanoScale Facility (CNF) à l'aide d'un masque. La couche intermédiaire a été découpée en forme et a également reçu les trous d'alignement correspondants via le processus de découpe au laser. Pour éviter les bulles d'air lors du remplissage des canaux de 10 mm de large, le canal a été conçu avec une géométrie conique évasée au niveau des orifices d'entrée et de sortie de fluide. L'assemblage sandwich en trois pièces (acrylique, film polymère, acrylique) a ensuite été collé par compression dans une presse.

Les lymphocytes T primaires ont été achetés auprès de StemCell Technologies qui a isolé les lymphocytes T pan de donneurs normaux en utilisant une séparation immunomagnétique négative. Les lymphocytes T primaires ont été cultivés dans des milieux ImmunoCult sans produits animaux additionnés de 100 µg/mL d'IL-2 humaine recombinante (StemCell, Vancouver, Colombie-Britannique, Canada). Les lymphocytes T primaires ont été décongelés, laissés au repos pendant la nuit dans le milieu, puis activés avec des anticorps CD3/CD28 (StemCell) selon les instructions du fabricant. Quatre jours après l'activation, les cellules ont été récoltées pour la transfection. Les cellules Jurkat ont été achetées auprès de Millipore Sigma (Millipore Sigma, Burlington, MA, États-Unis) et cultivées dans du milieu RPMI 1640 additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (R&D Systems, Minneapolis, MN, États-Unis). Toutes les cellules ont été maintenues à 37°C et 5% de CO2.

pCMV-GFP (ADN plasmidique; 3705 pb) a été acheté chez Altogen Biosystems (Las Vegas, NV, USA). L'ARNm Dasher GFP (1 kb) a été acheté chez Aldevron. SpCas9 et sgRNA ciblant le locus TRAC ou TRBC (TRAC : 5′-AGAGUCUCUCAGCUGGUACA-3′ ; TRBC : 5′-GGAGAATGACGAGTGGACCC-3′) ont été achetés auprès d'Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, États-Unis). Des complexes de ribonucléoprotéines (RNP) ont été formés en mélangeant des quantités équimolaires de SpCas9 et de chaque sgRNA et en incubant pendant 10 min à température ambiante avant d'être ajoutés aux suspensions cellulaires dans un tampon d'électroporation.

Pour les expériences d'électroporation, les cellules ont été récoltées, comptées et lavées deux fois dans un tampon d'électroporation à faible conductivité BTXpress Cytoporation (Conductivité : 9 × 10–3 S/m ; Holliston, MA, USA). Après le deuxième lavage, les cellules ont été remises en suspension dans le même tampon d'électroporation à une densité de 5 × 106 cellules/mL, sauf indication contraire. La cargaison à livrer a ensuite été ajoutée aux concentrations indiquées pour chaque expérience. Des solutions aqueuses contenant des cellules et de la cargaison ont ensuite été chargées dans une seringue, qui a ensuite été chargée dans une pompe à seringue (Chemyx, Stafford, TX, USA). Les suspensions cellulaires ont été coulées en continu dans la Flow Cell à 320 µL/min (largeur de canal de 2 mm) ou 1600 µL/min (largeur de canal de 10 mm) sauf indication contraire. Lorsque les cellules transitent sous l'électrode, elles ont été soumises à la forme d'onde de tension arbitraire indiquée générée par un générateur de fonctions (Siglent SDG 1032X ; Siglent, Technologies, Solon, OH, USA) et amplifiée par un amplificateur RF (TS250 ; Accel Instruments, Irvine, CA, USA). Lorsque les cellules sortent de la sortie, elles sont distribuées dans des puits contenant des milieux cellulaires préchauffés par un collecteur de fractions robotisé sur mesure. Le nombre de formes d'onde subies par les cellules lorsqu'elles transitent sous l'électrode est calculé comme suit

alors que la vitesse linéaire des cellules est calculée comme

Tout au long de chaque expérience, le générateur de fonctions et l'oscilloscope ont été contrôlés à l'aide d'un programme MATLAB personnalisé pour fournir une à dix formes d'onde de tension arbitraires préprogrammées pendant la durée de l'expérience (v. 2021a, Mathworks, Natick, MA, USA). La commutation de forme d'onde et l'échantillonneur automatique robotisé ont été programmés pour s'assurer que chaque puits contenait une population essentiellement pure de cellules qui recevaient une forme d'onde de tension préprogrammée. Les formes d'onde de tension et la tension aux bornes d'une résistance de 1 Ω en série avec la puce de flux ont été surveillées par un oscilloscope (Siglent SDS1104X-E, Siglent Technologies). L'efficacité de la transfection, la viabilité cellulaire et le rendement relatif ont été mesurés 24 h après la transfection (sauf indication contraire) par cytométrie en flux.

Pour les expériences Gene Pulser, les cellules ont été récoltées, comptées et lavées deux fois dans le tampon d'électroporation Gene Pulser (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Après le deuxième lavage, les cellules ont été remises en suspension dans le même tampon d'électroporation à une concentration de 5 × 106 cellules/mL. La cargaison à livrer a ensuite été ajoutée aux concentrations indiquées pour chaque expérience. Des solutions aqueuses contenant des cellules et de la cargaison ont ensuite été chargées dans une cuvette de 4 mm (Bio-Rad) et pulsées à l'aide d'un système d'électroporation Gene Pulser Xcell utilisant une seule onde carrée de 2 ms de 320 V pour l'ARNm ou de 360 ​​V pour l'ADN plasmidique (Bio-Rad). Après pulsation, les cellules ont été immédiatement transférées dans une plaque à 24 puits contenant du milieu préchauffé. L'efficacité de la transfection et la viabilité cellulaire ont été mesurées 24 h après la transfection par cytométrie en flux.

Les cellules primaires T ou Jurkat ont été prélevées 24 h (expression de la GFP) ou 72 h (TCR-α) après la transfection pour une analyse par cytométrie en flux à l'aide d'un analyseur de cellules ZE5 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). L'expression du TCR a été mesurée en colorant les lymphocytes T primaires à l'aide de l'anticorps anti-TCR humain AlexaFluor 488 à une dilution de 1:50 (BioLegend, San Diego, CA, USA; numéro de catalogue 306712). La viabilité a été mesurée en colorant les cellules avec le colorant de viabilité 7-AAD et en incubant pendant 5 minutes avant l'analyse en flux (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA). Au cours de l'analyse de flux, les cellules ont d'abord été fermées pour exclure les débris cellulaires en utilisant la zone de diffusion vers l'avant (FSC) par rapport aux parcelles de zone de diffusion latérale (SSC) (morphologie cellulaire sur les Fig. 3A, B). Les cellules individuelles ont ensuite été fermées à l'aide de parcelles FSC-zone et FSC-hauteur. Pour mesurer la viabilité, des cellules individuelles ont été fermées pour mesurer le pourcentage de populations 7-AAD négatives (vivantes) et positives (mortes) (viabilité sur les Fig. 3A, B). Pour mesurer l'expression de GFP ou de TCR, des cellules viables ont été fermées pour mesurer le pourcentage de cellules présentant une fluorescence verte par rapport aux contrôles à tension nulle (GFP sur les figures 3A, B).

Le nombre d'expériences indépendantes pour chaque jeu de données (n) est fourni dans les légendes des figures. Toutes les analyses et tous les tracés ont été réalisés avec GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA, USA). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart type.

Les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant, HGC, sur demande raisonnable.

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Ce travail a été réalisé en partie au Cornell NanoScale Facility (CNF), membre de la National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI), qui est soutenu par la National Science Foundation (Grant NNCI-2025233).

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Jacob A. VanderBurgh, Thomas N. Corso, Stephen L. Levy et Harold G. Craighead

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Conceptualisation : JAV, TNC, SLL, HGC ; méthodologie : JAV, TNC, SLL, HGC ; Validation : JAV ; analyse formelle : JAV ; enquête : JAV ; rédaction — brouillon original : JAV ; rédaction—révision et édition : JAV, TNC, SLL, HGC ; visualisation : JAV ; encadrement : JAV, TNC, SLL, HGC ; gestion de projet : JAV, TNC, SLL, HGC ; financement acquisition : TNC, SLL, HGC

Correspondance à Harold G. Craighead.

JAV, TNC et HGC sont répertoriés comme inventeurs sur les demandes de brevet liées à la technologie présentée et JAV, TNC, SLL et HGC ont un intérêt financier dans CyteQuest.

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Réimpressions et autorisations

VanderBurgh, JA, Corso, TN, Levy, SL et al. Plate-forme d'électroporation à flux continu évolutive permettant la transfection de lymphocytes T pour la fabrication de thérapie cellulaire. Sci Rep 13, 6857 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33941-2

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Reçu : 26 juillet 2022

Accepté : 21 avril 2023

Publié: 26 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-33941-2

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