Évaluation de la pénétration électrique des membranes cellulaires à l'aide de quatre - Le lac des cygnes de Shijiazhuang Co., Ltd

Microsystèmes & Nanoingénierie volume 8, Numéro d'article : 68 (2022) Citer cet article

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La pénétration électrique de la membrane cellulaire est vitale pour déterminer l'intérieur de la cellule par cytométrie d'impédance. Ici, nous proposons une méthode pour déterminer la conductivité de la membrane cellulaire à travers les niveaux d'inclinaison des impulsions d'impédance. Lors de la pénétration électrique, un courant à haute fréquence traverse librement la membrane cellulaire; ainsi, la distribution intracellulaire peut agir directement sur les impulsions d'impédance haute fréquence. La simulation numérique montre qu'une distribution inégale des composants intracellulaires peut affecter les niveaux d'inclinaison des impulsions d'impédance, et les niveaux d'inclinaison commencent à augmenter lorsque la membrane cellulaire est pénétrée électriquement. Des preuves expérimentales montrent que des fréquences de détection plus élevées (> 7 MHz) conduisent à une distribution plus large des niveaux d'inclinaison des impulsions d'impédance lors de la mesure des populations de cellules avec une cytométrie d'impédance à quatre fréquences. Cette découverte nous permet de déterminer qu'une fréquence de détection de 7 MHz est capable de traverser la membrane des cellules d'Euglena gracilis (E. gracilis). De plus, nous proposons une application possible de la cytométrie d'impédance à quatre fréquences dans le suivi de la biomasse de cellules uniques d'E. gracilis. Une impédance haute fréquence (≥7 MHz) peut être appliquée pour surveiller ces changements de biomasse, et une impédance basse fréquence (<7 MHz) peut être appliquée pour suivre les changements de biovolume correspondants. Dans l'ensemble, ce travail démontre une méthode de détermination facile pour la pénétration électrique de la membrane cellulaire, et la plate-forme proposée est applicable pour l'évaluation multiparamètre de l'état cellulaire pendant la culture.

L'évaluation de la biomasse des cellules individuelles joue un rôle vital dans de nombreux domaines, y compris l'analyse de l'état cellulaire1 et du mécanisme de croissance cellulaire2, ainsi que les questions environnementales et énergétiques3,4. À ce jour, plusieurs techniques, y compris l'imagerie des cellules vivantes5, la cytométrie en flux Raman6 et les sondes chimiques7, ont été appliquées avec succès pour l'évaluation à haut débit de la biomasse intracellulaire dans des cellules individuelles. Cependant, la plupart de ces approches basées sur l'optique prennent du temps et demandent beaucoup de main-d'œuvre, et les exigences strictes en matière de maintenance et d'étalonnage des points de focalisation du faisceau limitent leur robustesse et leur portabilité. Dans ce travail, nous avons proposé une méthode plus efficace et pratique pour caractériser la biomasse à travers les amplitudes des signaux d'impédance à haute fréquence.

Comme alternative, la cytométrie d'impédance s'est avérée applicable pour la caractérisation unicellulaire d'une manière sans étiquette et rentable8. À ce jour, la cytométrie d'impédance a été utilisée avec succès pour analyser la morphologie9, la rigidité10 et les états11 de cellules individuelles. Il a été démontré que l'amplitude et la morphologie des impulsions d'impédance dépendent du volume12 et de la forme13 des cellules individuelles, respectivement. De plus, la recherche a montré que la détection d'impédance à haute fréquence est applicable pour caractériser les propriétés de la membrane14,15. Par exemple, la conductivité de la membrane cellulaire augmente avec l'augmentation de la fréquence de détection au-dessus de 1 MHz14, et la conductivité de la membrane est liée à la viabilité cellulaire. Sui et al.16 et Zhong et al.17 ont montré qu'une fréquence de détection de 5 à 8 MHz est suffisante pour permettre au courant de traverser les membranes des cellules vivantes des mammifères. Cette conclusion est tirée des différences de conductivité membranaire entre les cellules inactivées et vivantes. Sans comparaison avec des cellules inactivées, il existe peu de rapports de méthodes applicables pour déterminer directement si la membrane est conductrice.

Lors de la mesure de la biomasse intracellulaire avec cytométrie d'impédance, il est nécessaire de déterminer la fréquence de détection qui peut pénétrer la membrane cellulaire. Notre solution consiste à quantifier le niveau d'inclinaison des impulsions d'impédance en tant qu'indice d'inclinaison13, puis à évaluer la conductivité de la membrane cellulaire à travers l'indice d'inclinaison de la population cellulaire à différentes fréquences de détection. Sur la base de nos travaux antérieurs, il a été constaté que la distribution des composants intracellulaires affectait le niveau d'inclinaison des impulsions d'impédance à haute fréquence (6 MHz) 18,19 car un courant à haute fréquence peut se propager à l'intérieur de cellules individuelles entre des composants intracellulaires non conducteurs. En revanche, un courant basse fréquence (500 kHz) ne peut pas pénétrer la membrane cellulaire et se propage principalement autour de la cellule18,19. Cette caractéristique facilite un nouveau procédé pour déterminer la fréquence de détection de l'intérieur et de l'extérieur de la cellule sur la base de l'indice d'inclinaison des impulsions d'impédance. Les intérieurs cellulaires sont plus hétérogènes que leurs morphologies dans une population. Lorsque la fréquence de détection est suffisamment élevée pour pénétrer la membrane cellulaire, l'indice d'inclinaison des impulsions d'impédance pour une population cellulaire sera plus varié. À notre connaissance, c'est la première fois que le niveau d'inclinaison des impulsions d'impédance est utilisé pour déterminer la fréquence de détection de l'intérieur de la cellule.

Dans ce travail, une cytométrie d'impédance à quatre fréquences a été utilisée pour analyser la conductivité de cellules uniques d'Euglena gracilis (E. gracilis), comme le montre la Fig. 1a. Tout d'abord, la détection d'impédance à différentes fréquences de cellules individuelles d'E. gracilis a été utilisée pour déterminer à quelle fréquence de détection le courant pouvait traverser la membrane cellulaire. Lorsqu'un champ électrique à haute fréquence pénètre dans la membrane cellulaire, la distribution intracellulaire inégale incline les impulsions d'impédance vers la gauche ou la droite (voir Fig. 1b), ce qui est un phénomène qui a été vérifié dans des simulations et des expériences. De plus, la technique de cytométrie d'impédance à quatre fréquences proposée (c'est-à-dire 500 kHz, 4 MHz, 7 MHz et 10 MHz) a été appliquée pour surveiller la biomasse de cellules uniques d'E. gracilis provenant de cultures de quatre jours dans diverses conditions basées sur la capacité de l'impédance à haute fréquence à détecter la biomasse intracellulaire. Le balayage électrique des cellules d'E. gracilis à l'intérieur et à l'extérieur a clairement montré des réponses cellulaires à différents milieux de culture avec des sources organiques ou des ions inorganiques, dans lesquels les cellules présentaient des différences significatives de multiplication, de volume et d'opacité. Le volume des cellules individuelles a été surveillé via des amplitudes d'impédance à basse fréquence, et leurs changements de biomasse ont été suivis par des amplitudes d'impédance à haute fréquence. Le système de détection d'impédance a été construit sur une carte FPGA (field-programmable gate array) (voir Fig. 1c) avec un amplificateur de transimpédance maison (voir Fig. 1d)20. Nous envisageons que l'indice d'inclinaison peut faciliter une méthode alternative pour déterminer la fréquence de pénétration électrique pour les membranes cellulaires. En outre, la plate-forme basée sur l'impédance proposée peut être adoptée pour évaluer les états cellulaires et la biomasse, ce qui est essentiel dans les applications pratiques impliquant des cultures cellulaires continues21,22.

une cytométrie d'impédance microfluidique pour la détection des cellules d'E. gracilis et de certaines structures importantes de cellules uniques d'E. gracilis. b Signaux d'impédance à quatre fréquences distinctes (c'est-à-dire 500 kHz, 4 MHz, 7 MHz et 10 MHz) et effet de la distribution des composants intracellulaires sur la morphologie des signaux d'impédance haute fréquence. c Analyseur d'impédance et (d) Réponse en fréquence de l'amplificateur de transimpédance auto-développé

Pour déterminer la fréquence de pénétration de cellules individuelles, nous avons effectué une simulation numérique 2D via le module AC/DC du logiciel COMSOL 5.6 Multiphysics (COMSOL Inc., Burlington, MA, USA). Ici, les cellules d'E. gracilis ont été simulées sous forme d'ellipses à une seule coque (rayon : 30 μm à axe long, 10 μm à axe court) et la membrane cellulaire (10 nm) a été modélisée à l'aide d'une approximation de l'impédance de contact23. Les composants intracellulaires ont été simplifiés sous forme de cercles 2D (épaisseur de membrane de 20 nm et diamètre de 1 μm) et ont été étroitement placés à l'intérieur gauche de la cellule18,19, comme le montre la figure 2a. D'autres paramètres de cellules18 utilisés dans la simulation sont répertoriés dans le tableau S1 dans les informations supplémentaires.

a Distribution du potentiel électrique à six fréquences différentes, dont 500 kHz, 4 MHz, 7 MHz, 10 MHz, 20 MHz et 100 MHz. La densité des lignes de courant noires indique la densité de courant (A m-2). b Impulsions d'impédance simulées aux quatre fréquences de détection utilisées dans ce travail. c – e Trois spectres simulés de fréquences en fonction de (c) indice d'inclinaison, (d) largeur normalisée et (e) impédance normalisée des impulsions d'impédance. Notez que l'amplitude de l'impédance et la largeur des impulsions d'impédance ont été normalisées sur la base des métriques d'impédance basse fréquence

Dans la détection d'impédance, la conductivité de la membrane cellulaire dépend de la fréquence et, comme le montre la figure 2a, la densité de courant à l'intérieur de la cellule augmente progressivement avec l'augmentation de la fréquence de détection. Le passage transparent du courant haute fréquence à travers la membrane cellulaire montre l'applicabilité de la détection d'impédance haute fréquence pour caractériser les composants intracellulaires. Dans la simulation, la densité de courant croissante à l'intérieur de la cellule indique la capacité de renforcement du courant haute fréquence à traverser la membrane cellulaire à mesure que la fréquence de détection augmente.

La figure 2b montre les impulsions d'impédance induites par le même modèle cellulaire à quatre fréquences de détection. À mesure que la fréquence de détection augmente, la résistance du modèle de cellule à la propagation du courant diminue, ce qui entraîne des amplitudes plus faibles des impulsions d'impédance. De plus, les impulsions d'impédance correspondant à des cellules de formes symétriques à basse fréquence de détection (500 kHz) sont symétriques. En revanche, l'intérieur de la cellule creuse droite est responsable de l'induction d'impulsions d'impédance asymétriques à des fréquences de détection élevées. La moitié droite des impulsions d'impédance dure plus longtemps que la moitié gauche. Ce phénomène peut être quantifié par l'indice d'inclinaison, qui est défini comme le rapport des durées de part et d'autre de l'impulsion d'impédance moins un (voir Fig. 2b). Plus précisément, l'indice d'inclinaison est de 0,009 pour des impulsions d'impédance symétrique à 500 kHz, alors qu'il est de -0,201 pour des impulsions d'impédance asymétrique à 10 MHz. Des informations plus détaillées sur l'indice d'inclinaison sont fournies sur la figure S1 dans les informations supplémentaires.

La figure 2c montre la dépendance de l'indice d'inclinaison sur la fréquence de détection de 100 kHz à 100 MHz. Tous les indices d'inclinaison sont comparés à la valeur (zéro) à une fréquence de détection basse de 100 kHz. Un indice d'inclinaison croissant indique l'impact croissant de la distribution des composants intracellulaires sur le niveau d'inclinaison des impulsions d'impédance. Au fur et à mesure que la fréquence de détection augmente, la structure intérieure du côté droit de la cellule entière incline progressivement les impulsions d'impédance vers la droite. À environ 10 MHz, l'indice d'inclinaison atteint une valeur extrême, et après cela, les composants intracellulaires commencent à être pénétrés électriquement (voir Fig. 2a). En comparaison, la largeur et l'amplitude des impulsions d'impédance (voir Fig. 2d, e) contiennent peu d'informations sur la distribution des composants intracellulaires. Les deux valeurs diminuent avec l'augmentation de la fréquence de détection en raison de la diminution de la résistance de la membrane cellulaire, comme cela a déjà été démontré dans diverses études8,24.

Les intérieurs cellulaires sont plus hétérogènes que leurs morphologies dans une population. Des structures internes hétérogènes provoquent une décentralisation croissante de l'indice d'inclinaison lorsque le champ électrique commence à pénétrer la membrane cellulaire. Les résultats de la simulation de la dépendance en fréquence de l'indice d'inclinaison mesuré à l'aide de quatre modèles différents, notamment des billes de 10 μm, des cellules creuses, des cellules creuses à gauche et des cellules creuses à droite, sont présentés sur les figures 3a à c. Aux fréquences de détection allant de 100 kHz à 100 MHz, le courant ne peut pas pénétrer les billes non conductrices. Ainsi, les impulsions d'impédance des billes ont toujours une forme symétrique et les indices d'inclinaison restent nuls (voir Fig. 3b). En revanche, la forme des impulsions d'impédance pour les cellules creuses est asymétrique une fois que le courant pénètre dans la membrane cellulaire. Par exemple, à des fréquences de détection supérieures à environ 100 kHz, l'indice d'inclinaison commence à augmenter à partir de zéro, et il atteint une valeur maximale à environ 10 MHz. Selon ce phénomène, il est possible que la propagation du courant à l'intérieur de la cellule provoque la forme asymétrique des impulsions d'impédance.

une analyse de la distribution du potentiel électrique à deux fréquences différentes, 500 kHz et 10 MHz, basée sur quatre types de modèles de simulation, notamment des billes de 10 μm, des cellules creuses, des cellules creuses gauches et des cellules creuses droites. b Dépendance en fréquence de l'indice d'inclinaison induit par des billes de 10 μm et des cellules creuses. c Dépendance en fréquence de l'indice d'inclinaison induit par les quatre types de modèles de simulation. d, e Graphiques de violon des résultats expérimentaux de l'indice d'inclinaison induit par (d) des billes de polystyrène de 10 μm et (e) des cellules d'E. gracilis à 12 fréquences de détection différentes, dont 100 kHz, 200 kHz, 300 kHz, 400 kHz, 500 kHz, 4 MHz, 7 MHz, 10 MHz, 11,5 MHz, 13 MHz, 14,5 MHz et 1 6 MHz

De plus, lorsqu'il y a des composants à l'intérieur de la membrane cellulaire, les niveaux d'inclinaison des impulsions d'impédance sont plus perceptibles que lorsque l'intérieur de la cellule est creux (voir Fig. 3c). Ainsi, l'indice d'inclinaison causé par la membrane cellulaire peut être ignoré pour les cellules normales dans la détection pratique car il y a toujours des composants intracellulaires, tels que des organites ou des macromolécules, dans la membrane cellulaire. De plus, l'indice d'inclinaison montre une dépendance à la distribution des composants intracellulaires avec l'augmentation de la fréquence de détection. Il n'y avait presque aucune différence dans les valeurs de l'indice d'inclinaison induit par le modèle de cellule creuse droite ou creuse gauche, à l'exception du signe. L'indice d'inclinaison mesuré pour un modèle de cellule creuse gauche est toujours positif lorsque la fréquence de détection est suffisante pour pénétrer la membrane, puisque la structure creuse gauche fait basculer les impulsions d'impédance vers la gauche. Pour les cellules creuses à droite, les indices d'inclinaison sont toujours négatifs. Avant que les composants intracellulaires ne soient polarisés par des champs électriques à haute fréquence, la différence d'indice d'inclinaison induite par les modèles de cellules creuses à gauche ou à droite augmente progressivement. De plus, cette différence qui se produit indique que la membrane cellulaire est électriquement pénétrée.

Les figures 3d, e illustrent les indices d'inclinaison induits par les cellules d'E. gracilis et les billes de 10 μm, respectivement. La cytométrie d'impédance à quatre fréquences a été utilisée pour mesurer des cellules individuelles ou des particules à 12 fréquences de détection différentes. Trois mesures indépendantes ont été effectuées, dans lesquelles nous avons appliqué le premier ensemble de fréquences de détection à moins de 500 kHz (c'est-à-dire 100 kHz, 200 kHz, 300 kHz, 400 kHz), le deuxième ensemble entre 500 kHz et 10 MHz (c'est-à-dire 500 kHz, 4 MHz, 7 MHz et 10 MHz) et le troisième ensemble au-dessus de 10 MHz (11,5 MHz, 13 MHz, 14,5 MHz et 16 MHz). Dans le cas des billes de polystyrène non conductrices, leur indice d'inclinaison variait dans une plage stable lorsque des fréquences inférieures à 13 MHz étaient appliquées. Après cela, une fréquence de détection plus élevée a entraîné une distribution plus décentralisée de l'indice d'inclinaison. Cela peut être dû au fait que la fréquence de détection (>13 MHz) dépasse la limite supérieure de notre système de détection d'impédance. Pour les cellules d'E. gracilis, l'indice d'inclinaison commence à se décentraliser à partir de 7 MHz ; ainsi, la pénétration électrique de la membrane cellulaire se produit. En comparaison avec l'indice d'inclinaison des billes de polystyrène, l'influence de l'appareil peut être exclue lorsque les fréquences sont inférieures à 13 MHz.

En comparant les figures 3c et e, nous pouvons conclure que la décentralisation croissante de l'indice d'inclinaison est indicative de la pénétration électrique de la membrane cellulaire. Dans ce travail, une fréquence de 7 MHz est suffisante pour pénétrer la membrane cellulaire pour la détection des composants intracellulaires. Nos résultats précédents appuient également cette conclusion18,19.

Après avoir déterminé la fréquence de pénétration électrique de la membrane cellulaire, nous avons utilisé des mesures d'impédance à basse fréquence (c.-à-d. 500 kHz et 4 MHz) pour suivre les changements de volume dans les cellules d'E. gracilis pendant la culture photomixotrophique, ainsi que des mesures d'impédance à haute fréquence (c.-à-d. 7 MHz et 10 MHz) pour surveiller l'accumulation de biomasse. Nous avons cultivé des cellules d'E. gracilis dans un milieu Koren-Hutner (KH) pendant quatre jours, et des signaux d'impédance ont été utilisés pour déterminer l'accumulation de biomasse de cellules d'E. gracilis cultivées de manière photomixotrophe. La détection d'impédance des cellules d'E. gracilis est illustrée dans le film S1 et la figure S2 dans les informations supplémentaires. Dans ce travail, une fréquence de détection maximale de 10 MHz a été utilisée, ce qui a bien fonctionné dans notre système et est également couramment utilisé pour l'analyse de l'intérieur des cellules8. La fréquence de détection la plus basse (500 kHz) a été utilisée dans nos travaux précédents pour caractériser le volume et la forme des cellules individuelles18,19. Les deux fréquences moyennes, à savoir 4 MHz et 7 MHz, ont été sélectionnées sur la base d'un espacement de 3 MHz.

Les cellules d'E. gracilis peuvent proliférer rapidement et accumuler du paramylon dans une culture photomixotrophe soit par photosynthèse, soit par digestion de sources de carbone organique dans le milieu de culture (milieu KH). Les cellules d'E. gracilis cultivées dans du milieu KH pendant quatre jours sont illustrées sur la figure 4a). Comme le montre la figure 4b, le nombre de cellules d'E. gracilis a continué d'augmenter pendant quatre jours de culture, passant d'environ 241 cellules/μL à 1936 cellules/μL. De plus, la biomasse des cellules d'E. gracilis a augmenté rapidement de 2,4 mg/mL à 8,5 mg/mL. La chute soudaine au jour 3 peut être due à une erreur de mesure.

a Comparaison du volume de cellules d'E. gracilis dans des expériences de quatre jours. La barre d'échelle indique 10 μm. b Analyse statistique de la prolifération cellulaire et de l'accumulation de biomasse des cellules d'E. gracilis. c Évolution temporelle des changements dans les diamètres électriques des cellules d'E. gracilis à quatre fréquences de détection (500 kHz, 4 MHz, 7 MHz et 10 MHz). d Évolution dans le temps des modifications de l'opacité électrique des cellules d'E. gracilis

Pour la caractérisation de l'impédance des cellules individuelles, illustrée à la figure 4c, toutes les propriétés diélectriques des cellules E. gracilis ont été calibrées à l'aide des propriétés diélectriques de billes de 10 μm. Au cours d'une période de culture de quatre jours, le diamètre électrique des cellules à 500 kHz est passé d'environ 10,89 à 11,46. En effet, la valeur de l'impédance basse fréquence dépend du volume de la cellule : une augmentation des diamètres électriques basse fréquence indique une augmentation du volume de la cellule8,18,19,24,25. À la fréquence de détection la plus élevée (10 MHz), le courant peut pénétrer librement dans la membrane cellulaire et se propager dans le cytoplasme entre les composants intracellulaires (c'est-à-dire le paramylon et les chloroplastes), permettant au diamètre électrique à haute fréquence d'être lié à la biomasse intracellulaire non conductrice des cellules individuelles. Par conséquent, les augmentations des diamètres à basse et à haute fréquence indiquent qu'il y a eu de légères augmentations du volume et de la biomasse au cours des 2 premiers jours.

Sur la figure 4d, l'opacité électrique des cellules (jours 1 à 4) est presque identique à celle des précultures (jour 0) puisque les nouvelles conditions de culture sont les mêmes que les conditions de préculture. Cependant, une augmentation du diamètre électrique à haute fréquence (c'est-à-dire 7 à 10 MHz) s'est produite le premier jour, plus tôt que l'augmentation du diamètre électrique à basse fréquence (c'est-à-dire 500 kHz) qui s'est produite le deuxième jour (voir Fig. 4c). Cela peut être dû au fait que lorsque les cellules d'E. gracilis ont été transférées dans un milieu frais, des nutriments organiques et des ions inorganiques adéquats ont induit la génération de composants intracellulaires avant la multiplication cellulaire. En détail, le taux de prolifération des cellules d'E. gracilis peut être accéléré par les ions Mg2+, Ca2+, Mn2+, Cu2+, Co2+ et Ni2+ dans le milieu26, et la multiplication cellulaire se produit un peu plus tard que la multiplication des chloroplastes. Pour les cellules d'E. gracilis, le nombre de chloroplastes dans chaque cellule est relativement stable, variant de 10 à 2027. Lorsqu'il y a 60 chloroplastes ou plus par cellule, la multiplication cellulaire se produit généralement28,29. Ainsi, les cellules d'E. gracilis peuvent avoir une biomasse intracellulaire croissante avant leur multiplication, ce qui se traduit par une augmentation légèrement plus précoce des diamètres électriques à haute fréquence par rapport à celle des diamètres électriques à basse fréquence.

Bien que certains ions métalliques inorganiques soient nécessaires à la croissance cellulaire d'E. gracilis et soient stabilisés pendant la synthèse de la biomasse26,30, les apports organiques peuvent être insuffisants dans l'environnement naturel. Ainsi, les cellules d'E. gracilis doivent se développer de manière photoautotrophe et la majeure partie de leur biomasse doit être produite par photosynthèse en utilisant le dioxyde de carbone de l'air comme source de carbone31,32. Pour analyser les effets des ions inorganiques sur la croissance cellulaire et l'accumulation de biomasse, des cellules d'E. gracilis ont été cultivées dans une solution de PBS 1 × comme témoin. Les propriétés diélectriques, la multiplication cellulaire et l'accumulation de biomasse des cellules d'E. gracilis cultivées dans du PBS et du milieu Cramer-Myers (CM) sont comparées et présentées à la Fig. 5.

a Comparaison du volume de cellules d'E. gracilis au cours d'expériences de quatre jours. La barre d'échelle indique 10 μm. b Analyse statistique de la prolifération cellulaire et de l'accumulation de biomasse des cellules d'E. gracilis. c Évolution dans le temps des variations des diamètres électriques des cellules d'E. gracilis à quatre fréquences de détection (500 kHz, 4 MHz, 7 MHz et 10 MHz). d Évolution dans le temps des changements d'opacité électrique des cellules d'E. gracilis

Sans sources de carbone organique dans le milieu de croissance, les cellules d'E. gracilis cultivées dans du PBS et du milieu CM pendant quatre jours sont présentées sur la figure 5a. En raison des sources de carbone limitées dans l'air, la synthèse de paramylon résultante était limitée. Ainsi, lorsque les cellules d'E. gracilis ont été transférées dans un milieu CM et une solution PBS, les cellules ont commencé à consommer de l'énergie stockée (paramylon), entraînant une réduction de la biomasse. De plus, l'effet des ions inorganiques sur la croissance cellulaire est illustré à la figure 5b. Malgré des sources de carbone insuffisantes, les cellules d'E. gracilis en milieu CM se divisent plus fréquemment que celles en solution PBS. Ce résultat a également soutenu plusieurs conclusions de recherche concernant les effets promoteurs des ions inorganiques sur la multiplication cellulaire d'E. gracilis33,34,35.

Bien qu'il y ait plus de cellules dans le milieu CM que dans le milieu PBS, les biomasses des cellules étaient presque les mêmes dans les deux cas. En d'autres termes, les cellules individuelles cultivées dans un milieu CM pourraient avoir moins de biomasse que les cellules cultivées dans une solution PBS. Cette conclusion a été confirmée par la détection d'impédance, comme illustré sur la figure 5c. Après quatre jours de culture, les diamètres électriques des cellules d'E. gracilis en solution PBS étaient plus grands que ceux des cellules en milieu CM à quatre fréquences de détection. Cela indiquait que les cellules d'E. gracilis dans la solution PBS avaient un volume plus important en raison d'un diamètre électrique à basse fréquence plus grand et avaient des composants intracellulaires plus denses en raison d'une opacité électrique plus élevée (voir Fig. 5d) par rapport aux cellules cultivées en milieu CM.

De plus, les diamètres électriques et les opacités électriques des cellules sont également de bons indicateurs du changement de milieu de culture. Lorsque les cellules d'E. gracilis ont été transférées dans un milieu de culture frais, le diamètre électrique et l'opacité des cellules, en particulier dans la solution PBS, ont rapidement diminué le premier jour de culture, ce qui peut être lié aux modifications de l'osmose et du pH du milieu de culture. Après deux jours d'adaptation à ces nouveaux environnements, l'opacité électrique et le diamètre des cellules d'E. gracilis sont revenus à la normale.

Compte tenu des conditions de croissance des cellules d'E. gracilis dans le milieu CM, le milieu KH et la solution PBS, nous avons conclu que certains ions inorganiques peuvent contribuer à la multiplication cellulaire. Surtout lorsque les cellules d'E. gracilis sont cultivées dans un environnement avec suffisamment de sources organiques et inorganiques, leur taux de prolifération et la productivité de la biomasse cellulaire atteignent leurs valeurs maximales. Les ions inorganiques peuvent s'accumuler dans les cellules36,37, et la biomasse qui en résulte est précieuse comme source de biodiesel.

Dans ce travail, nous avons proposé une méthode utilisant la distribution du niveau d'inclinaison des impulsions d'impédance pour déterminer si la fréquence de détection est suffisante pour pénétrer les membranes cellulaires. À des fréquences de détection élevées, la distribution des composants intracellulaires pourrait incliner les impulsions d'impédance, ce qui a été vérifié dans des simulations et des expériences. Les résultats expérimentaux ont montré que lorsque la pénétration électrique de la membrane cellulaire se produit, la distribution de l'indice d'inclinaison est progressivement décentralisée à mesure que la fréquence de détection augmente. La recherche a montré qu'une fréquence de détection de 7 MHz est suffisante pour pénétrer la membrane cellulaire des cellules d'E. gracilis.

Dans les cellules vivantes d'E. gracilis, il existe deux types de composants intracellulaires qui représentent la majeure partie de la biomasse, à savoir le paramylon et les chloroplastes. Paramylon, en tant que source de biodiesel38,39, représente plus de 50 % (p/p) du poids sec des cellules individuelles d'E. gracilis40. Une autre source de biodiesel est la membrane des chloroplastes, qui représente environ 22 % de la biomasse. En tant qu'alternative respectueuse de l'environnement et durable, l'énergie de la biomasse a suscité un intérêt considérable au sein des communautés scientifiques et industrielles4,41. Au Japon, par exemple, le biodiesel fabriqué à partir de cellules de la microalgue Euglena gracilis (E. gracilis) a été utilisé dans les navettes et les avions commerciaux comme "carburant renouvelable de nouvelle génération"42. Étant donné que les cellules de microalgues sont hétérogènes et que leur productivité de biomasse varie en fonction de leurs conditions de croissance, des techniques efficaces sont nécessaires pour surveiller l'accumulation de biomasse au cours des processus de culture. Dans ce travail, notre étude a montré que la cytométrie d'impédance est applicable pour analyser la morphologie cellulaire ainsi que les composants intracellulaires des cellules d'E. gracilis. De plus, les cellules de mammifères et d'autres types de cellules importantes dans les domaines de la biomédecine et en ce qui concerne l'environnement seront analysées à l'avenir.

Pour les composants intracellulaires des cellules d'E. gracilis, les molécules de paramylon individuelles sont enfermées dans une biomembrane et présentent souvent des degrés élevés de cristallinité, ce qui contribue théoriquement à la résistance élevée au courant33,43. Les chloroplastes sont des organites à double membrane qui se traduisent par une résistance au courant plus élevée à la même fréquence de détection par rapport à celle d'une cellule à membrane unique. Pour l'évaluation de la biomasse intracellulaire, il est nécessaire de déterminer la fréquence de détection à laquelle l'intérieur de la cellule peut être détecté. Dans ce travail, nous avons signalé que 7 MHz suffisent pour pénétrer la membrane cellulaire des cellules d'E. gracilis. Cependant, les propriétés diélectriques de divers organites et biomolécules sont encore inconnues. Selon le modèle numérique simplifié, les composants intracellulaires peuvent être polarisés à 10 MHz, mais expérimentalement, cette fréquence est insuffisante. Par conséquent, les paramètres diélectriques des composants intracellulaires nécessitent une étude supplémentaire pour une simulation plus précise.

La cytométrie d'impédance multifréquence a été largement utilisée dans la détection et l'analyse d'une seule cellule5,8,44. De plus, il est bien connu que les valeurs d'impédance à haute fréquence sont liées aux composants intracellulaires, car les courants à haute fréquence peuvent se propager à travers la membrane cellulaire24. Étant donné que la propagation du courant n'est pas visible dans les cellules, il nous manque une méthode directe pour déterminer si la fréquence de détection est applicable pour mesurer les composants intérieurs des cellules. Dans ce travail, nous avons proposé que la distribution des composants intracellulaires puisse être utilisée pour déterminer la pénétration électrique de la membrane cellulaire. Plus précisément, lorsque la pénétration électrique de la membrane se produit, la décentralisation de la distribution de l'indice d'inclinaison augmente avec l'augmentation de la fréquence de détection. En effet, les intérieurs cellulaires sont plus hétérogènes que leurs morphologies dans une population. Des structures internes hétérogènes entraîneraient une décentralisation croissante de l'indice d'inclinaison.

Ici, nous avons utilisé l'impédance basse fréquence pour effectuer une analyse des performances de la morphologie et du volume des cellules individuelles et l'impédance haute fréquence pour caractériser la biomasse intracellulaire. Le mécanisme de détection est soutenu par de nombreux travaux antérieurs. Nos travaux antérieurs ont montré que la détection à basse fréquence est applicable pour analyser la morphologie cellulaire, car le courant à basse fréquence se propage principalement autour de la cellule13,18,19. La dépendance de l'impédance basse fréquence sur le volume cellulaire a également été vérifiée8. De plus, il a été démontré que l'impédance à haute fréquence peut être utilisée pour analyser la quantité19, la distribution18 et la densité19,45 des composants intracellulaires. Ici, l'analyse de la biomasse basée sur l'impédance est basée sur l'applicabilité de l'impédance à haute fréquence pour surveiller la quantité et la densité des composants intracellulaires, ce qui a également été prouvé par des résultats expérimentaux.

Enfin, la plate-forme basée sur l'impédance proposée s'est avérée applicable pour évaluer les effets des conditions de culture sur la croissance cellulaire d'E. gracilis (volume, opacité et nombre) et l'accumulation de biomasse. Des amplitudes d'impédance à haute fréquence (≥ 7 MHz) peuvent être appliquées pour caractériser l'accumulation de biomasse, et des amplitudes d'impédance à basse fréquence (≤ 4 MHz) permettent la quantification du volume de cellules individuelles. Les changements dans l'accumulation de la biomasse et la culture dans différents milieux ont été suivis avec succès pendant quatre jours. À l'avenir, nous suggérons d'étendre l'application de l'indice d'inclinaison aux cellules de mammifères pour suivre les changements dans les propriétés membranaires concernant le vieillissement cellulaire, la cancérogenèse ou la lyse.

Des expériences ont été réalisées sur des cellules E. gracilis NIES-48 fournies par la Microbial Culture Collection du National Institute for Environmental Studies (NIES, Japon). Les cultures ont été cultivées dans des tubes de culture chacun avec un volume de travail de 13 mL sous éclairage continu (blanc chaud, 130–150 μmol/m2/s) à 28 °C. Pour étudier les effets des nutriments organiques sur la biomasse et la métabolisation des cellules individuelles, des cellules d'E. gracilis ont été cultivées par photomixotrophie en utilisant un milieu KH (pH : 3,5)46. Pour étudier les effets des ions inorganiques sur la croissance cellulaire, des cellules d'E. gracilis ont été cultivées de manière photoautotrophe en utilisant du milieu CM (pH : 3,9)47. Les cellules d'E. gracilis ont été cultivées en utilisant une solution saline tamponnée au phosphate 1 × (PBS, pH : 6,9) comme groupe témoin. Les composants détaillés des médias CM et KH ont été décrits par Wang et al.35. En bref, le milieu CM ne comprend aucune source de carbone organique, alors que le milieu KH contient du glucose et divers acides organiques et acides aminés comme sources de carbone48. Les milieux KH et CM contiennent des concentrations élevées d'ions inorganiques, tels que Zn2+, Mn2+, Fe3+, Cu2+, Co2+ et Ni2+, dont certains peuvent favoriser l'accumulation de biomasse et la multiplication des cellules d'E. gracilis36,49.

Pour l'étalonnage, des billes de polystyrène de 10 μm (Polysciences, USA) ont été utilisées comme particules de référence en raison de leurs propriétés physiques indépendantes de la fréquence, ce qui leur permet d'être considérées comme de parfaits isolants. Théoriquement, les amplitudes des impédances à quatre fréquences des perles devraient être identiques44.

Tous les échantillons ont été transférés dans du PBS 1 × et injectés dans des dispositifs microfluidiques à l'aide d'une pompe à seringue (NIHON KOHDEN CFV-3200). Le débit de l'échantillon était de 4,5 μL/min, ce qui donne un débit d'environ 1 250 échantillons/s pour la détection d'impédance dans ce travail. Trois répétitions de chaque expérience ont généralement été réalisées, c'est-à-dire que sur la figure S3, il y avait trois groupes de culture cellulaire pour chaque état de culture cellulaire.

Des expériences ont été menées sur une période de 4 jours (c'est-à-dire 0 à 4 jours) pour le milieu CM, le milieu KH et la solution 1 × PBS, chaque groupe contenant trois cultures indépendantes d'E. gracilis pour une caractérisation robuste. La croissance des cellules d'E. gracilis a été analysée en fonction du nombre de cellules, du poids sec, du volume cellulaire et de l'opacité. Ici, le poids sec des cellules d'E. gracilis a été déterminé à l'aide de 0,4 ml de cultures séchées à 100 ° C pendant plus de 4 h 50. Le volume des cellules a été déterminé à l'aide de diamètres électriques à basse fréquence (\(\left| {Z_{LF}} \right|^{1/3}\)), et le volume des composants intracellulaires a été déterminé à l'aide de diamètres électriques à haute fréquence (\(\left| {Z_{HF}} \right|^{1/3}\))18. Les changements de couleur dans les tubes de culture sur quatre jours sont illustrés à la Fig. S3 dans les informations supplémentaires, et la couleur verte dans les tubes de culture devient plus foncée à mesure que le nombre de cellules augmente.

Le microcanal de polydiméthylsiloxane (PDMS) dans la zone de détection mesure 40 μm de large et 35 μm de profondeur. Le canal est placé sur deux paires d'électrodes coplanaires, chaque paire étant constituée d'une source et d'une électrode de détection (dimensions : 30 μm de large, 30 μm d'étendue bord à bord et 80 μm d'étendue de paire). Chaque électrode est recouverte d'une couche d'or (Au) de 70 nm d'épaisseur sur une couche de chrome (Cr) de 70 nm d'épaisseur. La procédure de fabrication complète a été décrite en détail dans nos précédents travaux13,18.

Comme le montre la figure 1c, un amplificateur de verrouillage basé sur un réseau de portes programmables sur le terrain (FPGA) (Diligent Eclypse Z7, États-Unis) a été utilisé pour générer un signal de courant alternatif (CA) de 1 V à quatre fréquences de détection (c. Les signaux de courant provenant de deux électrodes de détection ont été convertis en signaux de tension avec des amplificateurs de transimpédance auto-développés (convertisseurs I/V), puis comparés à des amplificateurs différentiels (Diff). La tension différentielle résultante a ensuite été traitée sur la carte FPGA pour obtenir les signaux d'impédance correspondants. Tous les signaux d'impédance ont été enregistrés à une fréquence d'échantillonnage de 62,5 kHz à l'aide d'un dispositif de collecte de données (USB-6363 BNC, National Instruments, USA) et affichés en temps réel sur un ordinateur via NI DAQExpress (National Instruments, USA). Les étapes expérimentales d'utilisation de ce dispositif pour la détection d'impédance sont illustrées à la Fig. S4 dans les informations supplémentaires. Sur la Fig. 1d, la réponse en fréquence du convertisseur I/V montre sa capacité à convertir de manière stable des signaux de courant jusqu'à 18,48 MHz. Lorsque la fréquence de détection était supérieure à 10 MHz, le facteur d'amplification (gain) commençait à décliner.

Les signaux d'impédance ont été traités à l'aide de scripts personnalisés écrits dans MATLAB (version 2021b, MathWorks, USA). L'impédance (|Z|) de chaque perle ou cellule d'E. gracilis a été déterminée à l'aide d'un ajustement gaussien à un seul pic pour extraire l'amplitude du signal de crête pour chaque fréquence appliquée. Les amplitudes d'impédance moyennes des billes de 10 μm à quatre fréquences ont été déterminées automatiquement puis utilisées pour calibrer les diamètres électriques des cellules d'E. gracilis. L'opacité électrique moyenne (|ZHF|/|Z500kH|) et le diamètre (\(\left| Z \right|^{1/3}\)) des cellules d'E. gracilis ont été normalisés à l'aide de multiplicateurs linéaires simples pour garantir que les valeurs moyennes des deux paramètres d'impédance des perles étaient à opacité = 1 et diamètre = 10 à chaque fréquence. De plus, la morphologie et la distribution intracellulaire des cellules d'E. gracilis peuvent être évaluées aux basses et hautes fréquences, respectivement, en utilisant l'indice d'inclinaison (TLeft⁄TRight - 1) en comparant la durée de la moitié gauche et droite (TLeft⁄TRight) des impulsions d'impédance18.

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Kengo Suzuki

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Correspondance à Yaxiaer Yalikun.

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Reçu : 09 février 2022

Révisé : 16 mai 2022

Accepté : 30 mai 2022

Publié: 24 juin 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41378-022-00405-y

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