Mécanismes de cristallisation des protéines membranaires dans les 'bicelles'

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 11109 (2022) Citer cet article

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Malgré des progrès remarquables, principalement dus au développement de la LCP et de la cristallisation « bicelle », le manque d'informations structurelles reste un goulot d'étranglement dans la recherche sur les protéines membranaires (MP). Une raison majeure est l'absence de compréhension complète du mécanisme de cristallisation. Nous présentons ici des études de diffusion aux petits angles de l'évolution de la matrice de cristallisation "bicelle" au cours de la croissance cristalline MP. Initialement, la matrice correspond à l'état de bicelle liquide. Cependant, après l'ajout du précipitant, la matrice de cristallisation se transforme en un état gélatineux. Les données suggèrent que cette phase finale est composée de bicouches interconnectées en forme de ruban, où les cristaux se développent. Une petite quantité de phase multilamellaire apparaît, et son volume augmente concomitamment avec le volume des cristaux en croissance. Nous suggérons que la phase lamellaire entoure les cristaux et est essentielle pour la croissance cristalline, qui est également courante pour la cristallisation LCP. L'étude décrit les mécanismes de cristallisation MP "bicelle" et soutiendra la conception rationnelle de la cristallisation.

Les protéines membranaires (MP) jouent un rôle essentiel dans les processus cellulaires vivants tels que le transport des ions à travers la membrane, la conversion d'énergie et la transduction du signal1,2. Un tiers du génome humain code pour des protéines membranaires. En raison de leur rôle important dans la physiologie humaine, les protéines membranaires sont les cibles d'environ 60 % des médicaments actuellement utilisés3,4. À ce jour, la méthode la plus largement utilisée pour obtenir des structures de protéines à haute résolution est la cristallographie aux rayons X, qui nécessite des cristaux de protéines de haute qualité. Cependant, la cristallisation des protéines membranaires reste un défi majeur. Les structures uniques des protéines membranaires5 ne représentent qu'environ 1 % de toutes les structures protéiques uniques à haute résolution disponibles6. L'une des méthodes in méso est la cristallisation dans un mélange bicellaire7,8,9,10,11. Néanmoins, cette méthode conduit à l'élucidation de plusieurs PM importants, dont le mécanisme est encore flou et ne repose que sur des essais et erreurs exhaustifs. Le terme "cristallisation à partir de bicelles" peut ne concerner que l'état initial de la matrice, et l'évolution de l'état de la bicelle vers une matrice capable de supporter la croissance cristalline n'a pas été élucidée.

Des efforts considérables ont été déployés pour développer de nouvelles méthodes, matériaux et outils qui pourraient aider à surmonter ces obstacles. Cependant, malgré les tentatives passées, le taux de dépôt des structures protéiques membranaires (la première structure protéique membranaire a été déposée en 1985) est encore loin de ceux atteints pour les protéines solubles.

Pour relever le défi, une nouvelle méthode, à savoir la cristallisation des MP dans la matrice de la phase cubique lipidique (LCP), a été introduite en 199612. Cette approche a permis la cristallisation des MP difficiles (par exemple, les récepteurs couplés aux protéines rhodopsines13,14,15 et G) qui ont résisté à la cristallisation avec les méthodes de diffusion de vapeur standard pendant des décennies16,17,18.

L'approche de cristallisation in méso a été développée et élargie avec d'autres méthodes et outils, par exemple, l'utilisation de lipides aux propriétés variées pour créer la matrice LCP19, la cristallisation à partir de nanodisques à base de MSP20 ou liés à un polymère21,22 et la cristallisation à partir de bicelles7,9,10.

Auparavant, les bicelles avaient été introduites comme un modèle imitant la membrane potentiellement supérieur aux micelles23. Il a été démontré que certains mélanges de lipides et de détergents forment des particules en forme de disque, avec une bicouche lipidique, un noyau et un rebord stabilisé par un détergent fournissant un environnement stabilisant pour les MP en imitant les membranes cellulaires natives. La dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC) est souvent utilisée comme composant phospholipidique à longue chaîne des bicelles, et elle peut être dopée avec des phospholipides avec des longueurs de chaîne similaires mais des groupes de tête différents. D'autre part, le rebord peut être stabilisé par un dérivé à chaîne courte de sel biliaire tel que le 3-(cholamidopropyl) diméthylammonio-2-hydroxy-1-propanesulfonate (CHAPSO). Étant donné que le phospholipide à longue chaîne dans les bicelles est séquestré dans la région centrale plane, qui est dépourvue de phospholipide à chaîne courte ou de détergent, la région centrale d'une bicelle imite bien mieux une section de membrane naturelle que les micelles détergentes conventionnelles. La taille et les propriétés de ces particules lipidiques peuvent varier en fonction du rapport d'un lipide à longue chaîne à un détergent ou d'un lipide à chaîne courte (Q-ratio) et de la concentration en lipides. La variation de Q fournit une variété de phases bicelles similaires qui se prêtent à différents types d'études biologiques. En général, à un rapport lipidique élevé (Q > 2) et une large plage de concentration (Clp = 0,25–25 % (w/w)), des bicelles d'un diamètre d'environ 100–500 Å se forment24,25,26,27,28,29,30,31,32,33. La diminution de Q entraîne des bicelles plus petites24,34,35,36.

Les mélanges bicellaires présentent une plasticité structurelle en fonction du rapport lipide sur détergent (ou un lipide à chaîne courte) (Q), de la concentration en lipides (Clp), de la température (T) et de la composition chimique24,25,28,29,31,37,38,39,40,41,42,43,44,45.

En 2002, pour la première fois, S. Faham et JU Bowie ont présenté une nouvelle méthode de cristallisation des protéines membranaires basée sur des systèmes lipides/détergents formant des bicelles7. Les cristaux de bactériorhodopsine (BR) obtenus avec cette approche appartenaient au groupe spatial P21 avec des dimensions de cellule unitaire de a = 45, 0 Å, b = 108, 9 Å, c = 55, 9 Å, β = 113, 58 ° et une unité asymétrique dimérique et diffractée à haute résolution. On considère que les cristaux de BR étaient de type 1 avec un emballage typique en sandwich de type membrane de protéines, comme c'est le cas pour tous les cristaux cultivés par l'approche LCP. Depuis lors, plusieurs protéines membranaires importantes ont été cristallisées par cette approche7,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72 (voir tableau 1 et sa version étendue tableau S1).

Contrairement au paradigme dominant, notre analyse des données de la littérature montre que les structures publiées obtenues avec les cristaux cultivés avec l'approche "bicelle" étaient des deux types (pas seulement les cristaux de type I typiques de la cristallisation en méso). Alors que les protéines intégrales sans aucun domaine soluble dans l'eau forment généralement des cristaux de type I en forme de couche, les protéines avec des régions solubles dans l'eau relativement grandes (50 Å et plus) ont tendance à former des cristaux de type II. Cependant, des cristaux de type I peuvent se former même dans ce dernier cas en fonction des conditions de cristallisation (voir tableau S1). Notamment, il n'y a pas de dépendance certaine du type de cristal sur la composition de la solution précipitante. Cela peut signifier que le cristal de protéine membranaire qui se développe à partir de l'état initial de la bicelle peut emprunter des voies principalement différentes de l'état structurel de la matrice de cristallisation, ce qui donne deux types de cristaux principalement différents. L'objectif principal de ce travail est la croissance des cristaux de type I.

La morphologie des systèmes de bicelle a été étudiée par SAS, RMN, AFM et EM25,28,29,31,37,38,39,40,41,42,43,73. Pour Q adapté à la cristallisation (autour de Q = 3), le diagramme de phase résumé a des régions spécifiques, y compris des bicelles, des phases nématiques, telles que des micelles ramifiées en forme de ver ou des structures en forme de ruban, des structures multilamellaires et des membranes perforées (voir Figure supplémentaire S1 (A)). Il est connu que l'état de phase des systèmes lipidiques dépend de la température, ce qui peut avoir un impact sur la cristallisation des protéines74.

Fait intéressant, bien que la dépendance du système à la température soit complexe, la plupart des cristaux cultivés avec la méthode des bicelles ont été obtenus à température ambiante. En général, à basses températures et concentrations en lipides, le système est une suspension liquide contenant des bicelles. À mesure que la température et la concentration de Clp augmentent, le système forme des structures en forme de ver et de ruban28,30,37,38,39,75,76. Une augmentation supplémentaire de la température ou de la concentration provoque une transition vers une phase de gel constituée de structures unilamellaires ou multilamellaires et de membranes perforées24,28,29,37,38,39,75,77,78. Un système similaire de DMPC/CHAPSO à celui utilisé dans cette étude a été décrit précédemment24. Dans une plage de température allant de la température ambiante à 32 ° C, ce système est composé de structures bicellaires et en forme de ruban, alors qu'une partie du diagramme n'a pas été définie (Figure S1 (B)).

La plupart des diagrammes de phase publiés ont été obtenus pour des suspensions aqueuses pures des bicelles. Dans le cas d'une expérience de cristallisation, un précipitant et un MP sont ajoutés au système, et sa morphologie peut changer. Il a été montré que le comportement de phase du mélange bicellaire est affecté par une charge de membrane et une salinité tampon. Par exemple, une salinité élevée favorise la vésiculation et la formation d'agrégats dans les systèmes DMPC/DHPC/DGPC chargés79. À son tour, la présence d'une charge sur la membrane peut induire une perforation dans la bicouche lipidique24,30,80.

Ainsi, le terme souvent utilisé "cristallisation à partir de bicelles" peut uniquement signifier que la matrice de cristallisation de départ est une phase liquide comprenant des bicelles, des protéines membranaires (entourées de membranes natives ou de systèmes imitant la membrane) et un tampon. Cependant, ce qui se passe avec la matrice de cristallisation après le début de la cristallisation (lors de l'ajout d'un précipitant) et quel est l'état de phase (structure) lorsque les cristaux se développent n'est pas connu.

Ici, nous présentons les résultats des études de diffusion des rayons X et des neutrons aux petits angles (SAXS et SANS) sur l'évolution structurelle de la matrice de cristallisation de la bicelle initiale à l'état gélatineux final où les cristaux MP se développent. À de faibles valeurs de Q, les amphiphiles forment des micelles81, alors que, lorsque Q augmente, ils ont tendance à former des bicelles. Pour la cristallisation des protéines, les mélanges avec Q = 2–3 sont utilisés, et les amphiphiles les plus fréquemment utilisés sont le DMPC et le CHAPSO (ou DHPC) (voir la liste dans le tableau S1) 69,70.

La croissance des cristaux de protéines membranaires a été suivie simultanément dans les mêmes expériences. L'état final (semblable à de la gelée) de la matrice, où les cristaux se développaient, était formé par des bicouches interconnectées en forme de ruban.

Pour notre étude, nous avons utilisé un système de cristallisation bien testé et des conditions dans lesquelles la formation de cristaux de BR a déjà été observée7,46. Les expériences ont été divisées en quatre étapes suivantes (Fig. 1A) : (1) préparation du système de cristallisation sur glace ; (2) chargement du système de cristallisation dans un capillaire en verre ; (3) ajout d'un précipitant et suivi en temps réel de l'évolution de la structure de la matrice de cristallisation ; (4) suivi en temps réel de la formation de cristaux de bactériorhodopsine dans la matrice de cristallisation.

Séquence des étapes expérimentales. (A) Représentation schématique des étapes expérimentales de la cristallisation de la bactériorhodopsine dans les bicelles dans les capillaires. Etape 1 - préparation du système de cristallisation sur glace (mélange de bicelles et de membranes violettes) ; étape 2 - chargement du mélange bicellaire/membrane violette dans un capillaire ; étape 3 - ajout d'un précipitant et suivi des évolutions ultérieures de la matrice de cristallisation ; étape 4 - suivi de la formation des cristaux de BR. Au cours des étapes 2 à 4, la surveillance de la structure du système de cristallisation et de la croissance des cristaux a été effectuée à l'aide de SAXS en temps réel. (B) - Photographies du système de cristallisation à différentes étapes des expériences (alignées verticalement avec A) correspondant aux étapes 1 (jour 0), 2 (jour 4), 3 (jour 8 & 17) ; le système de cristallisation présente une phase homogène transparente/semi-transparente. À l'étape 4 (jours 24, 25 et 65), de petits cristaux sont apparus, puis ils ont atteint une taille maximale.

Au cours des étapes 2 à 4, la surveillance du système de cristallisation et la croissance des cristaux ont été effectuées à l'aide de SAXS (Figs. 2, 3). En parallèle, le système a également été observé à l'aide d'un microscope optique (Olympus SZX-ILLK200) (Fig. 1B).

Evolution de la matrice de cristallisation au cours du processus de cristallisation. Les courbes SAXS pour le mélange DMPC/CHAPSO pur sans PM (à gauche) et le système de cristallisation DMPC/CHAPSO/PM (à droite). Les données expérimentales pour le système de cristallisation avec et sans PM sont représentées par des cercles creux violet clair et orange, en conséquence. Les courbes SAXS pour PM sont représentées par des carrés violet foncé. Les approximations par facteurs de forme des bicelles et des rubans sont représentées par des lignes bleues. Les représentations graphiques des organisations structurelles de la matrice de cristallisation sont présentées à côté des courbes SAXS correspondantes.

Transformation des courbes SAXS du système de cristallisation au cours des différentes étapes du processus de cristallisation. (A) Les courbes SAXS liées aux différentes étapes du processus de cristallisation. Les flèches rouges dans la région des petits angles indiquent les pics d'interférence de la phase smectique lipide/détergent (les désignations des courbes sont données dans la légende ; la numérotation des étapes est décrite à la Fig. 1). (B) Les pics extraits des courbes SAXS (partie A) par soustraction de la ligne de base. Les courbes sont mises à l'échelle pour les séparer verticalement pour une meilleure visualisation. Les flèches noires « Lα1 » et « Lα2 » (représentées à la fois dans A, B) indiquent les pics lamellaires du premier et du deuxième ordre ; l'autre flèche noire "Lcryst 64 Å" indique le pic de la phase lamellaire locale liée à la surface de la protéine, l'espacement de ce Lcryst est de 64 Å. La flèche "68 Å" indique le précurseur de la phase Lcrist.

En plus du système de cristallisation contenant des protéines, nous avons également étudié (comme référence) le même système dans les mêmes conditions, mais sans protéines. Les données et les calculs indiquent que la présence de protéine n'affecte pas la morphologie de la matrice de cristallisation. Le rapport calculé de BR à DMPC dans notre système (le rapport molaire 1 : 200 ; le rapport de section transversale dans une membrane 1 : 17 ; le volume 1 : 6) appuie nos conclusions.

La préparation du système de cristallisation (mélange protéine/bicelle) a été réalisée sur de la glace selon la procédure standard décrite dans la section « Matériels et méthodes ». Il convient de noter qu'au lieu du BR solubilisé au détergent, nous avons utilisé des membranes violettes. Le système a été supposé présenter une structure bicellaire puisque le mélange DMPC/CHAPSO forme des bicelles à faibles concentrations et basses températures46. Pour vérifier cela, nous avons effectué toutes nos expériences SAXS à température ambiante ; entre les mesures SAXS, les capillaires ont été conservés dans une boîte à température contrôlée à 32 ° C. La concentration initiale du mélange DMPC/CHAPSO était de 5,6 %, ce qui est suffisamment faible pour les bicelles également à température ambiante. En utilisant la méthode de diffusion, nous avons observé la formation des bicelles à la fois dans notre système pur (pas de protéine) dans un tampon approprié (Fig. 2A) et dans le système de cristallisation à l'étape 1, étape 2 (Fig. 2B).

Le système de cristallisation refroidi a été transféré dans le capillaire (voir "Matériels et méthodes" et Figure S2). Ensuite, le système de cristallisation a été étudié par SAXS à température ambiante. A titre de comparaison, la suspension de membrane violette a été chargée dans un autre capillaire. Cette suspension contenait la même concentration en protéines que le système de cristallisation (8,4 mg/ml). Les courbes de diffusion pour les deux échantillons sont présentées sur la figure 2B. Dans la région des petits angles (jusqu'à 0,04 Å-1), les courbes suivent un comportement linéaire avec une pente de -1,8 pour le système de cristallisation et de -2,0 pour les membranes violettes. Ces pentes indiquent de grandes structures lamellaires dans les échantillons, dans notre cas, les membranes violettes. Nous avons soustrait l'intensité de diffusion des membranes violettes de l'intensité du système de cristallisation. Le résultat est représenté sur la figure 2B (la courbe est marquée par "différence d'intensité"). L'intensité de la différence peut être ajustée par un facteur de forme pour les bicelles (modèle 1) avec un rayon de 50 Å et une hauteur de 45 Å (voir ajustement sur la Fig. 2B et paramètres d'ajustement dans le tableau S2). De plus, nous examinons la structure de la matrice de cristallisation bicellaire pure en l'absence de membranes violettes en utilisant SAXS et SANS (voir la section "Matériels et méthodes" pour plus de détails). Le système de cristallisation présente un mélange bicellaire avec des paramètres similaires décrits dans le tableau S2, et les courbes d'ajustement sont présentées dans la figure 2A (pour l'expérience SAXS) et la figure S3 (pour SANS). Les données SAXS et SANS de ces systèmes sont cohérentes. Pour ajuster les données SAXS/SANS des bicelles, nous avons utilisé le modèle 1 d'un cylindre avec un profil de densité de longueur de diffusion (SLD) noyau-coque, qui est décrit dans "Matériels et méthodes". Un modèle similaire a été utilisé avec succès dans les études SAS précédentes de bicelles avec différentes teneurs en lipides/détergents44,82,83,84 (voir également la section "Profils SAXS pour les bicelles" dans le document texte S2).

En moyenne, les rayons de cœur sont d'environ 40 Å ; compte tenu de l'épaisseur de la ceinture, le diamètre total de la bicelle est d'environ 100 Å (voir la section "Différences des rayons de la bicelle" dans le document texte S2). Le diamètre des bicelles observé au travail24 pour le système analogique (mélange DMPC/CHAPSO, Q = 3) et obtenu en microscopie électronique était compris entre 100 et 500 Å. Conformément à l'ajustement de leur modèle SANS, le diamètre était d'environ 420 Å. Cependant, dans le travail mentionné, la concentration totale en lipide/détergent était de 0,25 % en poids, alors que, dans nos expériences, elle se situait dans une plage de 5,6 à 14 %. Comme le montre 38, la taille moyenne des bicelles dépend de manière critique de la concentration totale en lipides/détergents : le rayon pseudo-hydrodynamique diminue de plusieurs fois lorsque la concentration totale en lipides augmente de plusieurs fois. Par conséquent, le diamètre de la bicelle de ~ 100 Å obtenu dans notre étude correspond aux données actuelles sur les bicelles.

Les ensembles de données correspondant au mélange des bicelles avec les PM (c'est-à-dire le système de cristallisation) aux étapes 1 à 2 pourraient être décrits comme une somme des données de diffusion des PM et des bicelles pures (voir la Fig. 2B et la section "Ajustement des intensités de différence" dans le document texte S2). Ainsi, on peut décrire le système de cristallisation avant ajout d'un précipitant comme un simple mélange de bicelles et de membranes violettes.

Après que le système de cristallisation (mélange membrane/bicelle violette) ait été chargé dans le capillaire, un précipitant a été ajouté au-dessus du mélange de cristallisation dans le même capillaire avec un espace d'air entre le système de cristallisation et le précipitant (voir la section "Expérimental"). A partir de ce moment, le volume du système de cristallisation a commencé à diminuer en raison de la diffusion de l'eau de la matrice de cristallisation dans la solution précipitante. Au bout d'une semaine, le volume a diminué de 50 à 60 %, et la semaine suivante, il correspondait à 40 % du volume initial. Par la suite, seuls des changements mineurs ont été observés. Le diagramme de la diminution de l'évaluation du volume est présenté à la figure S4.

L'évolution des courbes SAXS au cours de l'étape 3 est présentée sur la figure 3. Les courbes ont subi des changements importants et la matrice de cristallisation a pris un état transitoire. Puis la matrice s'est stabilisée et n'a pas changé de morphologie. Ce dernier état est au centre de notre étude approfondie car il montre que les cristaux commencent à se développer à cet état de la matrice de cristallisation.

Il est important de noter que les changements cruciaux dans le profil SAXS aux premiers stades de l'étape 3 (Fig. 2C, D) sont principalement causés par une augmentation de la concentration en sel. Un tampon avec une concentration en sel accrue a une densité électronique plus élevée (voir la section "Valeurs SLD du tampon à différentes étapes" dans le document texte S2), c'est pourquoi le rapport entre les contrastes Δρ = ρ - ρbuffer des composants bicelle change considérablement avec la concentration en sel, conduisant à une variation du signal SAXS.

A ce stade, comme à l'étape 2, le système de cristallisation est un simple mélange de bicelles et de membranes violettes (voir Fig. 2D et Section "Ajustement des différences d'intensités" dans le Document Texte S2), mais leur concentration est plus élevée en raison de l'évaporation de l'eau du système de cristallisation. Pendant ce temps, les paramètres structurels des bicelles subissent de légères modifications (voir le tableau S2 et la section "Modifications SLD des bicelles" dans le document texte S2).

Avec un séchage continu, le système subit des changements morphologiques. Pour l'interprétation de la courbe SAXS dans la dernière étape de l'étape 3 (Fig. 2E, F), nous avons été guidés par le diagramme de phase obtenu pour le mélange DMPC/CHAPSO en 24, où le rapport molaire Q = 3 était proche de Q = 2,7 dans nos expériences. Les conditions de température et de concentration dans nos expériences sont marquées par un rectangle violet sur le diagramme présenté à la figure S1. Auparavant, la réorganisation des bicelles en agrégats allongés de type ruban et ver était détectée par différentes méthodes (SAS, microscopie électronique, RMN, microscopie optique polarisée)24,38,75,85,86. Etant donné que le DMPC a tendance à former une bicouche, ces objets allongés "en forme de ver" doivent avoir une section transversale aplatie (en forme de ruban) avec une épaisseur proche de l'épaisseur de la bicouche de DMPC. Ainsi, pour l'approximation de SAXS sur les rubans, le modèle d'un cylindre elliptique avec un profil de densité de longueur de diffusion cœur-coquille a été utilisé (voir "Matériels et méthodes", modèle 2). Le modèle analogue du cylindre elliptique était déjà utilisé en24 pour l'ajustement des données SANS ; cependant, dans le travail mentionné, le cylindre a été supposé être de densité égale, ce qui est suffisant pour s'adapter aux données SANS. Le cas des données SAXS nécessite un modèle core-shell pour les approximations théoriques car les parties hydrophobes et hydrophiles des micelles et/ou des bicouches ont un signe de contraste différent Δρ = ρ - ρbuffer (voir, par exemple, le tableau S3). En fait, il a été observé que l'épaisseur totale du ruban était légèrement supérieure à l'épaisseur attendue de la bicouche DMPC à la fois dans nos calculs (voir tableau S3) et dans le travail24.

La formation de rubans à partir de bicelles est associée à la redistribution du DMPC et des molécules CHAPSO entre la tête et la région de la ceinture des bicellules, entraînant en conséquence l'unification SLD et l'épaisseur de la coque hydrophile du ruban. Par conséquent, l'épaisseur de la coque hydrophile résultante du ruban est fixée sur la valeur Tshell = Max (Hhead, ΔR) = ΔR = 11,4 Å.

Comme les rubans proviennent de la phase initiale des bicelles, on s'attend à l'existence de phases intermédiaires présentées par les bicelles et les rubans. Cette hypothèse est en accord avec les régions correspondantes du diagramme de phase des bicelles (voir Figure S1B). Ainsi nous avons observé la coexistence de bicelles et de rubans dans le mélange DMPC/CHAPSO pur (sans PM). La courbe de diffusion pour ce système est approchée avec deux modèles : un ruban et un mélange du ruban avec des bicelles. Les résultats des deux approches sont présentés dans le tableau S3 et la figure 2E. En général, les paramètres structuraux obtenus ne diffèrent pas considérablement : la longueur du ruban (L) est d'environ 330 Å dans les deux cas, les rayons mineurs/majeurs du noyau hydrophobe des rubans sont de 25 Å/47 Å pour le cas du mélange ruban/bicelle et de 20 Å/43 Å pour les rubans uniquement (voir Tableau S3). Cependant, dans le cas du mélange ruban/bicelle, la valeur de χ2 est beaucoup plus faible (1,2 au lieu de 3,5) et correspond à une approximation plus précise.

Conformément aux volumes des noyaux hydrophobes des rubans et des bicelles dans le cas du mélange DMPC/CHAPSO (sans PM), au stade de la formation des rubans, pour lequel la courbe de diffusion de la Fig. 2E a été obtenue, un ruban est formé d'environ dix bicelles.

La courbe SAXS (voir Fig. 2F) obtenue aux dernières étapes de l'étape 3 pour le système de cristallisation (DMPC/CHAPSO/PMs) contient des pics de diffraction des phases lamellaires Lα, Lcryst et la "phase 500–700 Å". En général, la courbe de fond ici est similaire à la courbe de diffusion des rubans dans le cas du mélange DMPC/CHAPSO (voir Fig. 2E). En particulier, le fond est bien approximé avec le facteur de forme des rubans (voir la ligne continue sur la figure 2F), et les paramètres structurels obtenus sont proches de ceux obtenus pour les rubans en mélange DMPC/CHAPSO "pur" (voir tableau S3). Par conséquent, les rubans sont le composant principal du système de cristallisation à ce stade du processus de cristallisation.

Il est important de noter que la courbe de diffusion à ce stade ne suit pas un comportement linéaire avec une pente de -2,0 typique des structures oblates. Cela pourrait impliquer que les PM dans leur état initial sont absentes à ce stade. Au moins, la concentration des particules restantes n'est pas suffisante pour être détectée par SAXS. Cela indique qu'une majorité de PM se dissocie de manière synchrone avec la transition des bicelles aux rubans, et que les molécules de BR sont incorporées directement dans les rubans. Considérant que la quantité de membranes violettes est d'un ordre de grandeur inférieure à celle du mélange DMPS/CHAPSO, nous supposons que toutes les membranes violettes doivent se dissoudre.

Dans les dernières étapes de cristallisation, la matrice s'est stabilisée et les courbes SAXS n'ont pas montré d'autres changements significatifs. A ce stade, plusieurs pics sont observés dans les courbes SAXS (Figs. 2F et 3). Il existe deux groupes de pics d'origines différentes. Nous leur donnons les désignations suivantes : 500–700 Å et Lα. Le premier groupe présente des pics larges dans une région de petit angle q < 0,025 Å−1 (sur la Fig. 3A, les courbes indiquées comme étapes 3.3 et 4.1 ; les flèches rouges indiquent les pics). Ces pics ont été observés de un à sept jours avant et un jour après la détection des cristaux. Ensuite, ces pics ont disparu lorsque les cristaux ont commencé à croître. Ces pics étaient accompagnés de l'autre groupe de pics lamellaires Lα pour 70–80 Å (sera décrit dans la sous-section suivante) ou ont été observés juste avant l'apparition de ces pics lamellaires Lα (voir l'étape 3.3 de la Fig. 3A).

La première position de pic correspond au paramètre de réseau d = 2π / qmax 500–700 Å (la valeur moyenne pour la série d'échantillons est de 660 Å). Le deuxième pic correspondant à d = 2π / qmax ~ 350 Å pourrait être le pic de second ordre du pic (660 Å) mentionné ci-dessus ; le rapport de position de crête varie de 1:1,79 à 1:1,89. Ou ces deux pics peuvent avoir des origines différentes puisque le rapport des positions des pics n'est pas égal à 1:2. Il est à noter que leur apparition est synchronisée (voir la section "Discussion"), et le paramètre de réseau d ~ 350 Å peut être très proche de la longueur du ruban. Malheureusement, nous ne pouvons pas tirer de conclusions sur l'origine de ce pic car la longueur des rubans ne peut pas être estimée avec précision en raison de l'indisponibilité des données dans la plage q correspondant à la condition q L ≪ 1.

Étant donné que les pics de petit angle sont transitoires, il était difficile de surveiller leur comportement avec le même échantillon. Nous n'avons que deux courbes consécutives indiquant que le pic a augmenté d'intensité et que son maximum s'est déplacé vers des angles plus petits (mis en évidence par le rectangle en pointillés sur la figure 4). Notre discussion sur la nature possible de ces pics est donnée dans la section "Discussion".

Pics SAXS de la phase de cristallisation lipide/détergent avant ou au moment de la formation des cristaux. Les positions des pics correspondent à des distances de 500 à 700 Å (ces valeurs ont été calculées à partir des positions des pics du 1er ordre). Les graphiques sont présentés après soustraction de la ligne de base. Les pics observés ont disparu plusieurs jours après leur apparition. Chaque courbe est mesurée dans un capillaire différent. Les courbes sont mises à l'échelle pour les séparer verticalement pour une meilleure visualisation. Le rectangle en pointillés met en évidence deux courbes consécutives du même échantillon : ces courbes montrent qu'avec le temps, l'intensité maximale augmente et se décale vers des angles plus petits. Les flèches indiquent la position des pics d'ordre 2.

Le deuxième groupe de pics correspond à la phase lamellaire Lα avec le paramètre de réseau d = 70–80 Å. Il existe deux pics de diffraction lamellaire dans la plage médiane des vecteurs de diffusion q (Fig. 3, indiqués par "Lα1" et "Lα2"). Le rapport entre les positions maximales des pics est de 1:2. Ces pics sont apparus avant la formation des cristaux de BR et sont restés dans les courbes même après la formation des cristaux pendant toute notre période d'observation (deux mois). Leur intensité a augmenté et la position du maximum s'est déplacée vers un q supérieur au cours du temps (Fig. 3B et Figure S5). De plus, ces pics ont été observés dans les courbes pour les échantillons où nous n'avons pas trouvé de cristaux de BR. Nous avons étudié le comportement structurel de la matrice lipidique pure en l'absence de BR dans des conditions de cristallisation et découvert que les pics lamellaires y étaient également observés lors de la dernière étape du séchage de la matrice lipidique (Fig. 2G), ce qui indique que la nature de ces pics provient de la matrice lipidique.

Nous avons estimé les distances lamellaires d à partir de la 1ère position de pic qm1 comme d = 2π / qm1. D'abord, lorsque les pics lamellaires sont apparus, ils correspondaient à la distance d'environ 84 Å, puis, avec le temps, à 73 Å. Ces valeurs ont été résumées pour un ensemble d'échantillons (13 items). La distance de répétition d pour la matrice lipidique sans BR correspond à 74 Å. La transition du mélange bicellaire dans la phase lamellaire a été rapportée pour les systèmes purs DMPC/CHAPSO et DMPC/DHPC à des températures croissantes24,25,29,31,73,87. Les distances rapportées pour les mélanges DMPC/CHAPSO purs et DMPC/DHPC sont d'environ 62 Å et 65 Å en conséquence24,29, et pour les vésicules multilamellaires du DMPC pur sont d'environ 62 Å44,88. La plus grande valeur de 73 Å dans nos expériences peut être causée par la présence d'un tampon hautement concentré et de molécules BR.

Il est prouvé que les mélanges bicellaires peuvent former des membranes perforées24,37,38,39,75,80,89,90, où les pores sont bordés par un détergent à chaîne courte. SAXS est incapable de distinguer une bicouche homogène d'une perforée. Néanmoins, nous émettons l'hypothèse que des perforations putatives devraient exister pour connecter les membranes lamellaires et aider les protéines à migrer des bicouches vers le lieu de croissance des cristaux, conditions nécessaires à la croissance des cristaux. D'autres travaux pour obtenir des preuves à l'appui de cette hypothèse sont prévus.

Ainsi, après l'ajout du précipité, le système de cristallisation, qui est initialement un mélange de bicelles et de membranes violettes, commence à se rétracter : la concentration en bicelles et membranes violettes augmente. Puis les bicelles fusionnent en rubans, ce processus s'accompagne de la dissolution des membranes violettes. Également à cette étape, la formation d'une phase temporaire avec des paramètres caractéristiques de 500 à 600 Å est observée. Une phase multilamellaire est également formée avec un paramètre de réseau moyen de 73 Å. Cette phase reste à l'étape 4, lorsque la croissance cristalline est observée.

Lorsque la matrice de cristallisation s'est stabilisée, les cristaux de BR ont commencé à croître. Nous avons observé l'apparition des cristaux au vis-microscope (voir "Matériels et méthodes") dans les échantillons conservés à 32 °C de deux à trois semaines après le remplissage capillaire, et à cinq semaines, dans les échantillons conservés pendant 4 semaines à température ambiante puis déplacés dans une boîte thermorégulée à une température de 32 °C. Notamment, le déplacement des échantillons à 32 °C a accéléré l'apparition des cristaux. La croissance cristalline s'est accompagnée de pics de diffraction apparaissant dans les courbes de diffusion dans la plage des grands angles (Fig. 3, étapes numéro 4) correspondant au réseau cristallin (voir ci-dessous). Les intensités des pics cristallins ont augmenté à mesure que les cristaux de protéines se développaient (voir Figure S5). Ces pics cristallins ont toujours été observés en présence des pics de phase lamellaire Lα1, Lα2 comme mentionné ci-dessus dans une section "Etape 3".

Des cristaux de bactériorhodopsine appartenant au groupe spatial P21 avec des dimensions de cellule unitaire de a = 45, 0 Å, b = 108, 9 Å, c = 55, 9 Å, β = 113, 58 ° ont été obtenus par une méthode de cristallisation des protéines membranaires dans les systèmes «bicelle» dans le travail précédemment rapporté7. Dans nos expériences de cristallisation, les cristaux avec le même groupe spatial ont été trouvés. En utilisant les positions des pics (voir le tableau S4) obtenues à partir des données SAXS (voir les données initiales et soustraites dans les Fig. 5A, B, en conséquence) pour la matrice de cristallisation après la formation des cristaux, nous avons calculé les dimensions de la cellule unitaire comme a = 43,91 Å, b = 109,33 Å, c = 53,4 Å, β = 104,63 °, ce qui s'est avéré être proche des données précédemment rapportées7 (voir les détails du calcul de l'unité -dimensions des cellules dans "Matériels et Méthodes").

Données SAXS de la matrice de cristallisation après formation des cristaux (BM29, ESRF). (A) La courbe SAXS pour la matrice de cristallisation avec des cristaux (courbe bleue) et la ligne de base correspondante (courbe rouge). (B) La courbe SAXS de la matrice de cristallisation après soustraction de la ligne de base (orange). L'intensité est multipliée par q4 pour une meilleure observation des pics à grand angle. Les approximations gaussiennes des pics sont représentées en noir. Les indices Miller (pour les cristaux BR) et les nombres réflexes (pour les multicouches lipidiques Lα ou Lcryst) sont marqués au-dessus des pics correspondants (pour plus de détails, voir le tableau S4).

Il y a un pic de diffraction à 63,9 ± 0,4 Å (valeur moyenne pour sept échantillons, 21 courbes) que nous ne pouvons pas associer aux cristaux BR puisque la position de ce pic de diffraction est au-delà des paramètres de l'espacement du réseau BR. Sur les modèles SAXS 2D, ce pic est présenté sous forme de réflexes ponctuels (Fig. 6A). Nous supposons donc que ce pic peut être attribué à une phase lipidique quasi-cristalline. Ce pic est toujours observé en présence de pics lamellaires Lα et parfois avant que les cristaux de BR puissent être observés par vis-microscopie et SAXS. Son amplitude change de manière concomitante avec les intensités des pics de cristaux de BR (Figure S5). Les positions du pic Lcryst et des pics des cristaux restent inchangées dans leurs barres d'erreur pendant le temps d'observation. Le pic décrit peut avoir un "précurseur" : pour plusieurs échantillons, nous avons pu enregistrer un pic à 68 Å (Figs. 3B et 6B), puis après plusieurs jours, il s'est déplacé à 64 Å et a conservé cette position. La même position à 68 Å a été observée pour plusieurs échantillons dans lesquels nous n'avons enregistré les cristaux de BR ni par vis-microscopie ni par SAXS. Dans ce cas, la position du pic n'a pas changé pendant la durée d'observation (60 jours). Le système de cristallisation dans ces cas contient des agrégats de protéines non formés, comme on le voit par vis-microscopie (voir Figure S6(A, B)). Nous supposons qu'il y a nucléation lipide-protéine au début de la formation des cristaux ; ce noyau présente un espacement caractéristique de 68 Å se traduisant par l'apparition d'un pic "précurseur". Ensuite, un cristal commence à croître avec un espacement de réseau fixe, et le pic observé passe de 68 Å à 64 Å et ne change plus cette position pendant la croissance cristalline. Nous suggérons que le pic de 64 Å peut correspondre à la phase lipidique latérale locale physiquement liée à un cristal de BR. Il est similaire au système lamellaire décrit pour la cristallisation LCP17,91,92,93. L'observation directe de la phase lamellaire locale dans le cas d'une cristallisation en LCP est décrite pour BR93 et ​​le peptide transmembranaire DAP12-M94. Puisque cette phase lipidique locale est physiquement attachée au cristal, on s'attend à ce qu'elle soit orientée par rapport au cristal. De plus, les plans des membranes sont susceptibles d'être parallèles aux plans des cristaux de "type I". L'orientation de cette phase locale implique que le pic "précurseur" dans l'image de diffusion 2D est représenté par un ensemble de pics de diffraction séparés, qui peuvent être observés dans nos données (voir Fig. 6A).

Comportement du pic pour la phase lamellaire locale Lcryst. (A) Modèle 2D pour l'échantillon contenant les cristaux BR (correspond à l'étape 4.3 de la courbe 1D sur la Fig. 3). Les réflexions correspondant à la phase lamellaire locale Lcryst sont représentées par des flèches blanches. L'anneau diffusant appartient à la phase multilamellaire Lα avec un espacement d'environ 84 Å. (B) Comportement du pic de la phase lamellaire locale Lcryst sur les courbes 1D. Toutes les courbes SAXS appartiennent à différents points temporels du même échantillon. Les conditions de cristallisation sont les mêmes que pour l'échantillon de la Fig. 3.

Ainsi, après équilibrage du système de cristallisation, la formation et la croissance des cristaux commencent. A ce stade, les rubans sont principalement présentés, ce qui pourrait aider les protéines à migrer vers les centres de formation des cristaux à partir d'une phase multilamellaire Lα avec le paramètre de réseau 73 Å. Nous avons également observé la formation de la phase lamellaire vraisemblablement connectée directement à la surface cristalline (Lcryst) avec le paramètre de réseau 64 Å. Cette phase pourrait permettre aux protéines de se diffuser à la surface du cristal.

À l'aide de SAXS, nous avons étudié l'évolution structurale de la matrice de cristallisation lors de la cristallisation de la bactériorhodopsine dans le mélange DMPC/CHAPSO, initialement sous une forme bicellaire. Nous avons montré que dans l'étape initiale, la matrice présente un mélange de bicelles et de membranes violettes. Ainsi, initialement, la protéine n'est pas incorporée dans les bicelles, contrairement à d'autres systèmes de cristallisation, comme le LCP et les vésicules, où la protéine solubilisée dans un détergent est ajoutée au LCP.

Au début de l'évaporation, les courbes SAXS montrent des changements significatifs. Les changements sont causés par une concentration accrue de sel et l'augmentation correspondante de la densité électronique du tampon. Cependant, le DMPC et le CHAPSO sont toujours assemblés en bicelles.

Dans les étapes suivantes, en présence d'un précipitant et d'eau d'évaporation de la matrice, celle-ci se transforme en une phase composée de structures en forme de ruban. Dans cette étape, les courbes de diffusion ne montrent pas de changements spectaculaires, et après cela, une croissance cristalline est observée. La phase est visqueuse, ce qui peut indiquer une ramification et une interconnectivité des rubans. La connexion des rubans dans un réseau continu devrait faciliter la livraison des molécules protéiques au site de nucléation et la croissance cristalline.

Il est également possible que les rubans s'alignent dans un emballage ordonné. Par conséquent, les pics non cristallins apparaissant dans la courbe de diffusion peuvent être interprétés comme un ordre à courte portée entre les rubans. Ainsi, au stade ruban, les pics temporaires ont été observés dans une région à petit angle des courbes (q < 0,025 Å−1). Ces pics correspondent aux paramètres d'espacement de 270–350 Å et 500–700 Å pour deux directions d'ordre. Il existe deux interprétations possibles de ce qu'est cette phase "500–700 Å". La première interprétation est que ces pics correspondent aux paramètres de réseau 270–350 Å et 500–700 Å et peuvent être associés à la formation d'une phase cholestérique constituée de structures rubanées. L'hypothèse est basée sur le fait que le paramètre de réseau est beaucoup plus grand que la longueur du ruban (voir tableau S3). En termes de phase cholestérique, les paramètres de réseau 500-700 Å correspondent à la période de rotation le long de l'axe directeur (la distance sur laquelle une rotation complète de 360° est effectuée) connue sous le nom de pitch95. Le deuxième pic avec un paramètre de réseau de 270 à 350 Å correspond à la longueur des rubans obtenus à partir de l'approximation des courbes SAXS (voir Tableau S3 et Fig. 2F), ce qui peut indiquer l'orientation supplémentaire des rubans au sein de cette hypothétique couches cholestériques. La deuxième interprétation est que ces pics avec des paramètres de réseau de 270–350 Å et 500–700 Å peuvent être associés à la formation d'un smectique composé de structures en forme de ruban. Les smectiques sont caractérisés par deux paramètres d'ordre - entre les couches et entre les éléments d'une couche. Dans notre cas, les couches smectiques pourraient être formées par les rubans. Le premier pic smectique correspond à une distance de 500 à 700 Å entre les couches. Le deuxième pic correspond à la distance entre les rubans dans une couche de 270 à 350 Å. La formation des structures nématiques et des micelles de type ver orientées dans les mélanges DMPC / DHPC a été montrée à l'aide de la microscopie optique polarisée et de la diffusion de neutrons aux petits angles (SANS) 28, 75, 89. La référence28 relative au mélange DMPC/DHPC pur indique l'apparition d'un large pic à q ~ 0,015 Å-1 dans les courbes SANS. Elle correspond à environ 450 Å, ce qui est proche de nos paramètres. En outre, la formation de micelles de type ver orientées dans les mélanges DMPC / DHPC a été démontrée par différentes méthodes28,31,73,75,89,90.

Une interprétation sans ambiguïté de ces pics 270–350 Å et 500–700 Å est impossible en utilisant uniquement SANS et SAXS. Nous avons déterminé que les structures en forme de ruban sont le composant dominant du système de cristallisation ; cependant, on ne sait toujours pas comment les rubans sont connectés et exactement comment ils sont mutuellement orientés. Pour comprendre les données importantes de la phase, des expériences supplémentaires, en particulier une étude complémentaire en microscopie électronique sont souhaitables. Indépendamment de la véritable nature de ces pics, nous avons émis l'hypothèse que la formation de telles structures ordonnées pourrait induire l'ordre des protéines dans la matrice de cristallisation et favoriser la cristallisation des protéines.

Puis nous avons observé une phase multilamellaire avec un paramètre de distance de 73 Å. L'apparition et la croissance des cristaux ont été détectées par SAXS et vis-microscopie dans les étapes où la phase multilamellaire Lα se formait également dans la matrice. Cette preuve met en évidence que la présence de structures lamellaires étendues est une condition importante pour la croissance cristalline. Vraisemblablement, cette phase accompagne une croissance cristalline similaire à celle observée avec les cristaux développés par LCP. Les structures en forme de ruban sont supposées être le composant dominant du système puisque les courbes SAXS présentent une bonne approximation par un facteur de forme des rubans.

Il apparaît que la présence d'une phase lamellaire locale (Lcryst) liée à la surface du cristal permet la croissance cristalline. La présence de Lcryst se manifeste par l'apparition de pics de diffraction dans nos courbes de diffusion. Lors de la nucléation du cristal, le Lcryst a une distance de 68 Å. Puis, lors de la formation et de la croissance du cristal, ce paramètre décroît jusqu'à 64 Å et maintient cette valeur jusqu'à la fin de l'observation (60 jours). La protéine peut diffuser à la surface du cristal via cette phase.

Ainsi, contrairement au paradigme existant, notre étude montre que l'état gélatineux de la matrice de cristallisation « bicelle », plutôt que la bicelle initiale, est l'état où les cristaux se développent. Nous supposons que ces structures lamellaires doivent être interconnectées pour aider les protéines à migrer des bicouches vers le lieu de formation des cristaux, conditions nécessaires à la croissance des cristaux. D'autres travaux pour obtenir des preuves à l'appui de cette hypothèse sont prévus.

Fait important, lors de la formation des cristaux, une petite quantité de phase multilamellaire apparaît et son volume augmente de manière concomitante avec le volume et le nombre de cristaux en croissance. Nous concluons donc que la phase lamellaire entoure les cristaux et est essentielle pour la croissance cristalline, comme c'est également le cas pour la cristallisation LCP17,91,92,93.

Nous résumons toutes les informations disponibles sur l'évolution de la matrice de cristallisation qui ont été mentionnées dans notre travail dans le schéma suivant d'apparition/disparition séquentielle de divers éléments structuraux illustrés à la Fig. 7. Le processus commence par une phase fluide contenant un simple mélange de bicelles et de membranes violettes. Initialement, la concentration de bicelles et de particules augmente en raison d'une diminution du volume de la matrice de cristallisation lors du séchage (voir Fig. S4). Puis les bicelles fusionnent en rubans ; ce processus s'accompagne de la dissolution des PM. Les rubans forment une phase gélatineuse, qui est le composant principal de la matrice de cristallisation lors de l'apparition et de la croissance des cristaux de BR. Cependant, entre l'apparition des rubans et des cristaux, plusieurs autres types d'éléments structuraux apparaissent : la phase lipidique lamellaire Lα, la « phase 500–700 Å » et la phase lamellaire locale Lcrist. Lα correspond à des membranes lipidiques multilamellaires apparaissant du fait de la fusion de rubans. La quantité de Lα augmente (voir Fig. S5A) simultanément avec une lente diminution de la concentration du ruban. Pendant un temps beaucoup plus long que la croissance des cristaux (~ 100 jours), les rubans peuvent complètement se transformer en phase Lα (voir Fig. 2G). Après Lα, la "phase 500–700 Å" a été détectée. Cette structure d'ordre élevé a un paramètre de réseau égal ou même supérieur à la longueur des rubans. Selon la littérature28,31,73,75,89,90, de telles structures peuvent correspondre à des smectiques ou des cholestériques (nématiques chiraux). Le rôle exact de cette structure d'ordre élevé dans le processus de cristallisation des protéines est discutable. La "phase 500–700 Å" apparaît pendant environ une semaine puis elle disparaît. Lcryst correspond à des membranes multicouches situées à la surface des cristaux de protéines et permettant à la protéine de diffuser à la surface des cristaux. Dans les échantillons où une croissance cristalline a été observée, l'apparition de Lcryst précède l'apparition de cristaux, ce qui indique que Lcryst correspond également aux zones de nucléation des protéines. Ensuite, l'intensité des pics I(q) de Lcryst et des cristaux croît de manière synchrone (Fig. S5(A)). Enfin, des cristaux de protéines membranaires apparaissent dans l'échantillon de cristallisation.

Le schéma démontrant l'évolution de la matrice de cristallisation et l'apparition/disparition séquentielle de divers éléments structuraux : un mélange de bicelles et de PM, des rubans, la phase lamellaire Lα, la "phase 500-700 Å", la phase lamellaire locale Lcryst et les cristaux BR (voir la description plus détaillée dans le texte principal). Suivant Katsaras et al.31, nous présentons la "phase 500–700 Å" comme nématique chirale ; cependant, la véritable nature de cette phase n'est toujours pas claire. L'axe correspond au temps, à la complexité (c'est-à-dire au nombre/quantité du nouvel élément structurel apparu) et à la concentration, respectivement. La concentration est donnée en unités arbitraires (les éléments structuraux ont des plages de concentration différentes ; ici, la concentration est présentée sur la même échelle pour plus de clarté ; les dépendances des concentrations par rapport au temps sont présentées qualitativement).

Nos résultats aident à faire la lumière sur la cristallisation méso MP et bien que des questions demeurent, les résultats rapportés ici soutiennent fortement l'utilisation de ce type de cristallisation en utilisant une conception rationnelle, ce qui la rend considérablement plus efficace. Cette approche pourrait également aider à la cristallisation efficace des députés pour la conception de médicaments basée sur la structure, le développement de vaccins basés sur des députés appartenant à différents agents pathogènes, par exemple le SRAS-CoV-2, et d'autres applications biomédicales.

Le lipide 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DMPC) a été acheté auprès d'Avanti Polar Lipids Inc; Le 3-([3-cholamidopropyl]diméthylammonio)-2-hydroxy-1-propanesulfonate (CHAPSO), le 2,5-hexanediol, le triéthylène glycol ont été achetés chez Sigma-Aldrich.

Le mélange protéine/bicelle a été préparé selon la procédure décrite précédemment96. CHAPSO et DMPC ont été mélangés à un rapport molaire de 1:2,69 (CHAPSO:DMPC). L'eau désionisée (18,2 MQ.cm) a été ajoutée à ce mélange pour atteindre une concentration finale de bicelles de 35 % (p/v). Le mélange a été homogénéisé par refroidissement cyclique sur glace, vortex et bref chauffage (à 40°C). Le mélange préparé a été conservé à -20 °C.

Des membranes violettes contenant de la bactériorhodopsine (BR) ont été purifiées à partir de cellules Halobium Salinarum, comme décrit dans 97, et concentrées à une concentration de BR d'environ 10 mg/ml. Des membranes violettes refroidies et une solution à 35 % de bicelles ont été mélangées dans un rapport de 4:1 (v/v), doucement remises en suspension et placées sur de la glace. La solution précipitante a été ajoutée au mélange membrane/bicelles dans un rapport de 1:4 (v/v) de sorte que la composition du tampon du mélange protéine/bicelle soit 0,49 M NaH2PO4, 36 mM hexanediol, 1,26 % triéthylène glycol. La solution précipitante contenait 2,45 M de NaH2PO4, 180 mM d'hexanediol, 3,5 % de triéthylène glycol, pH = 3,7. La solution finale de protéine-bicelle a été incubée sur de la glace pendant 30 min et placée dans des capillaires. Le mélange final protéine/bicelle contenait 5,6 % de bicelles (concentration totale DMPC + CHAPSO) et 8 à 9 mg/ml de BR (nous avons étudié plusieurs séries de capillaires).

Étant donné que les outils de cristallisation standard (tels que la goutte assise ou la goutte suspendue) ne conviennent pas pour effectuer simultanément des expériences à petit angle, nous avons développé une procédure de cristallisation équivalente dans les capillaires en verre.

Le schéma d'un capillaire est présenté à la figure S1. Des capillaires en verre borosilicaté d'un diamètre extérieur de 1,5 mm et d'une épaisseur de paroi de 0,01 mm ont été utilisés ; la longueur des capillaires était de 80 mm. Le transfert du système de cristallisation (mélange BR/bicelle) dans les capillaires a été réalisé à l'aide d'une aiguille rachidienne de diamètre extérieur 1,1 mm et de longueur 90 mm. Avant de remplir le capillaire, tous les matériaux (capillaires, aiguilles et solutions) ont été refroidis pour assurer la consistance liquide de la suspension protéine-bicelle.

La suspension protéine-bicelle a été placée au fond du capillaire. La solution précipitante a été placée au sommet de sorte qu'un intervalle d'air de 6 à 8 mm se soit formé entre la suspension de protéine-bicelle et la solution précipitante. L'extrémité du capillaire a été scellée avec de la cire (Figure S2 et Fig. 1).

Un lot de capillaires a été stocké à 32 °C, l'autre à température ambiante. Nous avons remarqué que les changements dans le système de cristallisation étaient très lents à température ambiante en raison d'une petite zone d'évaporation limitée par le diamètre du capillaire. Par conséquent, après 4 semaines, nous avons placé tous les capillaires dans une boîte d'incubateur à 32 °C. La cristallisation a été effectuée à 32°C. La croissance cristalline a été contrôlée par un vis-microscope.

La plupart des expériences SAXS ont été réalisées sur un instrument Rigaku à l'Institut de physique et de technologie de Moscou (Dolgoprudny, Russie)98. L'instrument Rigaku SAXS était équipé d'une caméra à sténopé attachée à un générateur de faisceaux à haut flux de rayons X à anode rotative (MicroMax 007-HF) fonctionnant à 40 kV et 30 mA (1200 W). La longueur d'onde des rayons X λ était de 1,54 Å. Un détecteur multi-fils rempli de gaz rigaku ASM DTR Triton 200 (diamètre de la zone active est de 200 mm, la taille des pixels est de ~ 260 μm) a été placée à une distance de 2,0 m de la plage Q couverte (0,024 Å - 1 ≤ Q ≤ 0,8 Å - 1). L'intégration azimutale des images 2D obtenues a été réalisée à l'aide du logiciel Saxsgui (Rigaku Innovative Technologies, Inc., et JJ X-ray System Aps). Une expérience SAXS supplémentaire pour caractériser les cellules unitaires de cristaux de BR dans un échantillon a été réalisée sur la ligne de lumière bioSAXS BM-29 à l'ESRF (Grenoble, France)99. L'énergie de travail du BM-29 (ESRF) était de 12,5 keV, le clapier expérimental était équipé d'une table en marbre abritant un tube de vol de longueur modulaire (distance de 3,5 m entre l'échantillon et le détecteur utilisé pour cette expérience), un détecteur 2D (Pilatus 1 M), et un passeur d'échantillons automatisé, et la plage de valeurs q réalisable était de 0,0025 à 0,5 Å−1. La collecte, le traitement et l'analyse initiale des données ont été effectués de manière automatisée à l'aide de BsxCuBE et du logiciel de ligne de lumière dédié dans le cadre EDNA100.

Les mesures SANS ont été effectuées au temps YuMO d'un spectromètre de vol (IBR-2, Dubna, Russie) avec un système à deux détecteurs101,102. Les positions des détecteurs étaient à 4,5 et 13 m des positions des échantillons. Les longueurs d'onde neutroniques utilisées λ de 0,5 à 8 Å avec la plage q réalisable de 0,007 à 0,5 Å−1. Le traitement des données brutes a été effectué avec le programme SAS103.

Pour le recalcul des dimensions des cellules unitaires à partir des données SAXS, la somme des carrés suivante des écarts associés a été minimisée :

où qexpi est la position du ième pic expérimental, qtheor ([hkl]i) est la position théorique du pic qui correspond aux indices de Miller [hkl]i donnant la position du pic le plus proche de qexpi (voir Tableau S4). Les positions théoriques des pics pour un cristal à cellule unitaire monoclinique sont données par l'expression suivante (2) :

Le programme Primus de la suite logicielle ATSAS104 a été utilisé pour le traitement primaire des profils SAXS et SANS 1D I(q). Les données SAXS pour les solutions aqueuses de molécules amphiphiles (liposomes unilamellaires, bicelles, nanodisques, micelles détergentes et protéines membranaires solubilisées) démontrent généralement l'intensité maximale dans la plage de 0,1 à 0,2 Å-1 (voir, par exemple, Fig. 2A), qui est causée par de fortes inhomogénéités de densité électronique (les parties hydrophobes ont généralement un contraste négatif par rapport au solvant, tandis que les parties hydrophiles ont un contraste positif). Dans les études de tels systèmes par SAXS, des erreurs et des ambiguïtés peuvent survenir si l'on utilise des modèles avec des profils de densité électronique homogènes, ce qui a été montré pour le complexe protéique membranaire NpSRII/NpHtrII solubilisé dans un détergent105,106. Par conséquent, une interprétation correcte des données SAXS de tels systèmes nécessite des modèles avec différentes densités de longueur de diffusion pour différentes parties des objets étudiés (en cas de bicelles - une ceinture détergente, des têtes hydrophiles et des queues hydrophobes de la bicouche lipidique). A cet effet, deux modèles ont été utilisés.

Le modèle 1 (utilisé pour les bicelles) est un cylindre circulaire avec un profil de densité de longueur de diffusion noyau-coquille (voir Fig. 8A, nous avons utilisé un modèle de plugin basé sur le modèle SasView du cylindre et le core_shell_bicelle). Conformément aux données rapportées précédemment pour le modèle 3S de la bicouche DMPC107 (ce qui est analogue à notre cas), l'épaisseur de ce noyau (Htail) a pu être fixée à une valeur de 28,8 Å ; conformément à la surface connue par lipide, AL = 61,8 Å2, la SLD du noyau hydrophobe (ρtail) a pu être calculée et fixée (voir tableau S3). Le petit rayon du cylindre central est R, le rapport grand/petit rayon ε = 1. Les faces du coeur correspondent aux têtes polaires hydrophiles du DMPC, et les molécules d'eau liées aux têtes polaires. L'épaisseur de cette couche de face (Hhead) est un paramètre d'ajustement. Nous avons supposé que la ceinture du cylindre est formée par CHAPSO. Conformément au modèle atomique de la molécule CHAPSO108, l'épaisseur de ceinture ΔR dans nos calculs a été fixée sur la valeur de 11,4 Å.

Modèles utilisés pour l'approximation des données SAS. (A) Modèle 1 : cylindre circulaire avec un profil de densité de longueur de diffusion cœur-coquille (dans nos calculs, nous avons utilisé ε = 1 pour les bicelles). (B) Modèle 2 : cylindre elliptique avec un profil de densité de longueur de diffusion noyau-coquille.

Le modèle 2 (utilisé pour les rubans) est un cylindre elliptique avec un profil de densité de longueur de diffusion cœur-coquille (voir Fig. 8B, nous avons utilisé un modèle de plugin basé sur deux modèles SasView de la catégorie "cylindre": un core_shell_cylinder et un elliptical_cylinder).

L'ajustement des courbes SAS avec les modèles de bicelles et de rubans a été réalisé à l'aide du programme SasView 4.2.2109. L'optimisation des paramètres structurels dans les modèles mentionnés a été réalisée par minimisation de l'expression suivante :

où Nexp et Nparam sont respectivement les nombres de points expérimentaux et les paramètres ajustés ; (qi, Ii, σi) est un ensemble de données expérimentales SAS. Les équations (4–7) pour la courbe modèle Imodel(qi) sont données dans le document texte S1.

Les calculs ont été effectués en supposant que le facteur de structure peut être négligé (S(q) = 1). Même si les concentrations d'échantillons sont élevées (5,6 à 14 %), et qu'une certaine influence du facteur de structure sur la courbe de diffusion est inévitable, cette influence n'est pas si critique pour déterminer le type d'objet, en particulier pour faire la distinction entre les bicelles et les rubans, ce qui a été démontré dans les travaux (19). Cependant, les paramètres structurels déterminés lors du processus d'ajustement peuvent différer des paramètres réels. En fait, il n'existe aucun moyen de prendre correctement en compte S(q) car il n'existe pas de modèles théoriques appropriés. C'est un grand défi de considérer l'effet du facteur de structure à des concentrations plus faibles en utilisant la dilution et en suivant les expériences SAXS puisque la structure des objets étudiés dépend de la concentration et change avec le temps. Ainsi, des expériences avec d'autres concentrations d'échantillons ne permettront pas d'obtenir des informations sur les états du système qui se produisent dans des expériences réelles de cristallisation de protéines membranaires et qui sont étudiées dans ce travail.

Les données à l'appui des conclusions de ce manuscrit sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Nous remercions le personnel de l'ESRF et de l'EMBL-Grenoble pour leur aide et leur soutien dans l'utilisation de la ligne de lumière BM29. Nous remercions le Frank Laboratory of Neutron Physics (FLNP), JINR à Dubna (Russie) pour avoir accordé l'accès au spectromètre de diffusion de neutrons aux petits angles YuMO (IBR-2).

TNM reconnaît l'attribution du plénipotentiaire roumain au JINR dans le cadre du thème JINR 04-4-1142- 2021/2025 (#367/11.05.2021 point 17). Yu.LR et AVV reconnaissent le soutien du ministère des Sciences et de l'Enseignement supérieur de la Fédération de Russie (accord 075-03-2022-107, projet FSMG-2021-0002). AVR reconnaît le ministère des Sciences et de l'Enseignement supérieur de la Fédération de Russie (accord n° 075-00958-21-05, projet n° 730000F.99.1.BV10AA00006). Les méthodes de cristallisation des protéines ont été développées dans le cadre de la Fondation russe pour la recherche fondamentale (numéro de projet 19-29-12022). Le traitement des données SAXS/SANS a été soutenu par la Russian Science Foundation (numéro de projet 21-64-00018).

Ces auteurs ont contribué à parts égales: Tatiana N. Murugova, Oleksandr I. Ivankov et Yury L. Ryzhykau.

Frank Laboratory of Neutron Physics, Joint Institute for Nuclear Research, 141980, Dubna, Russie

Tatiana N. Murugova, Oleksandr I. Ivankov, Yury L. Ryzhykau, Dmytro V. Soloviov, Daria V. Skachkova, Andrey V. Rogachev, Alexey V. Vlasov et Alexander I. Kuklin

Centre de recherche sur les mécanismes du vieillissement et les maladies liées à l'âge, Institut de physique et de technologie de Moscou, 141700, Dolgoprudny, Russie

Tatiana N. Murugova, Yury L. Ryzhykau, Dmytro V. Soloviov, Andrii V. Ishchenko, Andrey V. Rogachev, Alexey V. Vlasov et Alexander I. Kuklin

Université nationale Taras Shevchenko, Kiev, 01033, Ukraine

Oleksandre I. Ivankov

Institut pour les problèmes de sécurité des centrales nucléaires du NAS ukrainien, Kiev, 03028, Ukraine

Oleksandr I. Ivankov & Dmytro V. Soloviov

EMBL Hamburg Outstation, 22607, Hambourg, Allemagne

Kirill V.Kovalev

Précédemment à EMBL-Grenoble Outstation, 38000, Grenoble, France

Ronde d'Adam

Particules uniques, agrégats et biomolécules et instrument de cristallographie femtoseconde en série (SPB/SFX), European XFEL GmbH, 22869, Schenefeld, Allemagne

Ronde d'Adam

Institut de traitement de l'information biologique (IBI-7 : biochimie structurale), Forschungszentrum Jülich, 52425, Jülich, Allemagne

Christian Baeken & Oleksandr A. Volkov

JuStruct : Centre de biologie structurale de Jülich, Forschungszentrum Jülich, 52428, Jülich, Allemagne

Christian Baeken & Oleksandr A. Volkov

Institut de Biologie Structurale Jean-Pierre Ebel, Université Grenoble Alpes–Commissariat à l’Energie Atomique et aux Energies Alternatives–CNRS, 38027, Grenoble, France

Valentin Ier Gordely

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TNM, OII et YLR ont contribué à parts égales et chacun a le droit de s'inscrire en premier dans les documents bibliographiques. Conceptualisation : VIG, AIK ; plan d'expériences : VIG, AIK, TNM, OII, AVI, OAV, AVR ; collecte de données : TNM, OII, Dm.VS, Da.VS, AR, AIK ; analyse et interprétation des données : TNM, OII, YLR, Da.VS, VIG, AIK ; Extraction PM : CB ; tutelle : VIG, AIK ; rédaction—ébauche originale : TNM, OII, YLR, KVK, AVV, AVI, AIK, VIG ; rédaction—révision et édition : AR, VIG, AIK

Correspondance avec Tatiana N. Murugova, Alexander I. Kuklin ou Valentin I. Gordeliy.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Murugova, TN, Ivankov, OI, Ryzhykau, YL et al. Mécanismes de cristallisation des protéines membranaires dans les 'bicelles'. Sci Rep 12, 11109 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-13945-0

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Reçu : 01 mars 2022

Accepté : 31 mai 2022

Publié: 30 juin 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-13945-0

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