La biosynthèse du cholestérol module la différenciation dans les cellules de la crête neurale crânienne murine - Le lac des cygnes de Shijiazhuang Co., Ltd

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 7073 (2023) Citer cet article

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Les cellules de la crête neurale crânienne (cNCC) sont une population de cellules embryonnaires multipotentes qui donnent naissance à un ensemble diversifié de types de cellules. Ces cellules sont particulièrement vulnérables aux facteurs de stress métaboliques externes, comme en témoigne l'association entre l'hyperglycémie maternelle et les malformations congénitales. Nous étions intéressés à étudier l'effet de diverses concentrations de glucose et de pyruvate sur le métabolisme, la migration et la différenciation du cNCC à l'aide d'un modèle cellulaire de crête neurale murin établi (O9-1). Nous avons observé de manière inattendue un modèle d'expression génique suggérant l'induction de la biosynthèse du cholestérol dans des conditions d'appauvrissement en glucose dans les cellules O9-1. Nous avons en outre montré que le traitement avec deux inhibiteurs différents de la synthèse du cholestérol interférait avec la migration et la différenciation cellulaire, inhibant la chondrogenèse tout en améliorant la différenciation des cellules musculaires lisses. Comme l'arhinie congénitale (nez externe absent), une malformation causée par des mutations dans SMCHD1, semble représenter, en partie, un défaut de cNCC, nous nous sommes également intéressés à étudier les effets de la disponibilité du glucose et du cholestérol sur l'expression de Smchd1 dans les cellules O9-1. L'expression de Smchd1 a été induite dans des conditions de glucose élevé alors que les inhibiteurs de la synthèse du cholestérol ont diminué l'expression de Smchd1 au cours de la chondrogenèse. Ces données mettent en évidence un nouveau rôle pour la biosynthèse du cholestérol dans la physiologie du cNCC et démontrent que la variabilité phénotypique humaine chez les porteurs de la mutation SMCHD1 peut être liée, en partie, à la sensibilité de SMCHD1 au dosage du glucose ou du cholestérol au cours du développement.

Les cellules de la crête neurale (NCC) sont une population de cellules embryonnaires transitoires dérivées de l'ectoderme qui donnent naissance à un ensemble diversifié de types de cellules. Au cours du développement embryonnaire, les NCC en migration traversent divers environnements avec des nutriments uniques et une activation localisée d'enzymes qui peuvent avoir un impact sur leur programmation génétique et leur physiologie1. Des études examinant l'effet des perturbations de la disponibilité du substrat montrent que la régulation spatio-temporelle du développement est en partie déterminée par des changements dans le métabolisme2. Les changements métaboliques dans la NCC sont temporairement associés à, et peuvent en fait stimuler, des étapes critiques de l'ontogenèse de la NCC telles que la prolifération, la migration et la différenciation3. De plus, les NCC semblent être particulièrement vulnérables aux facteurs de stress métaboliques externes, l'hyperglycémie en étant un excellent exemple. Le diabète gestationnel est associé à un risque plus élevé de malformations congénitales affectant les tissus et les organes dérivés du NCC (par exemple, les systèmes cardiovasculaire, squelettique et nerveux central), ce qui suggère que l'hyperglycémie maternelle est hautement toxique pour le NCC4,5,6,7. En effet, les premières études in vitro ont démontré que des conditions de culture élevées en glucose inhibent la prolifération et la migration des cNCC du rat en raison de la surproduction d'espèces réactives de l'oxygène8. Des travaux plus récents chez le poussin ont en outre montré que l'exposition à une glycémie élevée régule à la hausse l'apoptose et l'autophagie médiée par ERK dans le développement de cNCC9 et supprime la différenciation des cellules souches embryonnaires en une lignée neuronale10. Cependant, aucune étude n'a été menée pour déterminer comment la disponibilité des nutriments affecte la physiologie des NCC en utilisant la lignée cellulaire O9-1, une lignée multipotente dérivée de NCC embryonnaires de souris11.

Des défauts dans l'ontogénie, la migration et/ou la différenciation de la NCC donnent lieu à un ensemble de conditions appelées neurocristopathies. Le syndrome de microphtalmie de Bosma arhinia (BAMS) est une malformation congénitale extrêmement rare et grave qui semble refléter un défaut primaire du NCC crânien12, des cellules placode crâniennes13 ou de leur interaction. Le BAMS consiste en la triade clinique de l'arhinie (nez absent), des défauts oculaires et de l'hypogonadisme14 et est causé par des mutations du gène Structural Maintenance of Chromosomes Flexible Hinge Domain-containing 1 (SMCHD1)15,16. Cependant, la présence d'une pénétrance incomplète et d'une expressivité variable dans les familles multiplex suggère que d'autres facteurs in utero peuvent influencer l'expression ou la fonction de SMCHD1. Nous avons émis l'hypothèse que la disponibilité des éléments nutritifs pourrait être l'un de ces facteurs. Le diabète gestationnel n'a pas été signalé dans les grossesses BAMS, cependant, le BAMS est susceptible d'être sous-déclaré (< 100 cas signalés au cours du siècle dernier15), les lignes directrices pour le diagnostic du diabète gestationnel varient d'un pays à l'autre et sont devenues plus strictes au fil du temps, et il a été récemment reconnu que l'hyperglycémie maternelle est associée de manière linéaire au risque périnatal sans seuil évident17. Ainsi, en utilisant le système modèle O9-1, nous avons également étudié l'effet de la disponibilité des nutriments sur l'expression de Smchd1.

Nous avons émis l'hypothèse que différentes conditions métaboliques auraient un impact sur la physiologie du cNCC. Nous avons étudié l'effet de 4 conditions de culture : glucose élevé (HG = 25 mM de glucose, 1 mM de pyruvate), contrôle du glucose (CG = 5,55 mM de glucose, 1 mM de pyruvate), pas de glucose (NG = 0 mM de glucose, 1 mM de pyruvate) et pas de glucose avec 2 × pyruvate (NG2P = 0 mM de glucose, 2 mM de pyruvate). Alors que les protocoles de culture cellulaire utilisent fréquemment des conditions HG pour maximiser la prolifération, la condition CG a été sélectionnée pour représenter au mieux la physiologie de l'embryon en développement18. La condition NG a été choisie pour déterminer si cNCC pouvait utiliser des substrats métaboliques alternatifs tels que le pyruvate ; le pyruvate présentait un intérêt particulier compte tenu de sa position au carrefour de multiples voies du métabolisme du carbone et de ses rôles démontrés dans l'activation du génome embryonnaire19 et la physiologie de la NCC3,20,21.

Pour déterminer comment différentes conditions de glucose (HG, CG, NG, NG2P) affectent l'expression génique dans le cNCC de souris, une analyse de réseau de corrélation de gènes pondérée (WGCNA) a été utilisée pour interpréter les données RNA-Seq. WGCNA construit des réseaux de co-expression génique en tenant compte des schémas de corrélation entre les gènes à travers les échantillons22. Le regroupement hiérarchique est ensuite utilisé pour identifier des modules ou des réseaux de gènes avec une expression génique hautement corrélée. Ces modules peuvent ensuite être liés à d'autres traits (ici, la concentration en glucose) et interrogés pour l'enrichissement fonctionnel. Les modules d'intérêt sont sélectionnés en fonction de l'importance moyenne des gènes, de l'appartenance au module (connectivité des gènes au sein d'un module), de la relation avec un trait ou des voies biologiques. Pour sélectionner les modules d'intérêt, nous avons d'abord considéré la force de l'appartenance au module (connectivité > 0,6). Étant donné que notre conception expérimentale comprenait un gradient de concentrations de glucose, nous avons ensuite choisi d'explorer les deux modules où il y avait également un gradient linéaire dans le changement d'expression de HG à CG à NG à NG2P. Seize modules de gènes co-exprimés dans différentes conditions de glucose ont été identifiés. Dans le module turquoise, l'expression des gènes a diminué dans toutes les conditions, tandis que dans le module bleu, l'expression des gènes a augmenté dans toutes les conditions (Fig. 1A, B, tableau supplémentaire S1). L'analyse de surenrichissement du modèle turquoise a révélé des voies associées au cycle cellulaire et à la réparation de l'ADN (Fig. S1 supplémentaire), tandis que l'analyse du module bleu a révélé de manière inattendue la biosynthèse du cholestérol, le métabolisme des sphingolipides et des glycosphingolipides (Fig. 1C, Fig. S1 supplémentaire). Le glucose et les métabolites dérivés du glucose fournissent des matières premières pour la synthèse du cholestérol et régulent les enzymes biosynthétiques du cholestérol et son absorption23. On s'attendrait donc à ce que la déplétion en glucose régule à la baisse la biosynthèse du cholestérol; cependant, les membres de la voie de biosynthèse du cholestérol, y compris Hmgcr, l'enzyme limitant la vitesse de synthèse du cholestérol, et Hmgcs1, qui catalyse la production de 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-CoA (HMG-CoA)24,25, ont montré une expression accrue dans les conditions NG et NG2P par rapport à HG (Fig. 1D). La protéine de liaison à l'emopamil (Ebp), qui joue un rôle clé dans l'étape finale de la biosynthèse du cholestérol, a également été régulée positivement dans les conditions CG vs HG (Fig. 1D). Nous avons ensuite directement mesuré le cholestérol libre, le cholestérol estérifié et le taux de cholestérol total (c'est-à-dire la somme des niveaux de cholestérol libre et estérifié) dans les diverses conditions de culture de glucose. Aucune différence significative n'a été observée dans le cholestérol libre ou total, alors que le cholestérol estérifié était inférieur dans HG par rapport aux conditions CG, NG et NG2P (Fig. 2A – C).

La disponibilité du glucose a un impact sur le transcriptome du cNCC. (A) Valeurs de corrélation de Pearson entre le niveau d'expression du gène du module et la disponibilité du substrat ; glucose élevé (HG = 25 mM de glucose, 1 mM de pyruvate), contrôle du glucose (CG = 5,55 mM de glucose, 1 mM de pyruvate), pas de glucose (NG = 0 mM de glucose, 1 mM de pyruvate) et pas de glucose avec 2 × pyruvate (NG2P = 0 mM de glucose, 2 mM de pyruvate) avec des valeurs p ajustées (entre parenthèses) sont indiqués dans chaque bac ; une corrélation de 1 ou -1 indique une forte relation positive ou négative, respectivement. (B) Les cartes thermiques et les graphiques à barres affichent l'expression génique à l'échelle et les valeurs propres des gènes pour les modules turquoise et bleu. (C) Analyse de la voie des gènes du module bleu filtrés pour l'appartenance au module> 0,6. (D) Heatmap des gènes impliqués dans la biosynthèse du cholestérol.

La disponibilité du glucose régule les niveaux de cholestérol estérifié dans la CNCC. Taux de cholestérol total, estérifié et libre normalisés aux protéines dans le cNCC cultivé dans les conditions HG, CG, NG et NG2P. n = 3 par groupe. Les valeurs sont indiquées sous forme de moyenne ± SD. *p < 0,05, **p < 0,01.

Nous avons entrepris d'examiner l'importance de la biosynthèse du cholestérol dans la physiologie de la CNCC en utilisant deux médicaments qui sont structurellement différents et qui ont un impact sur la voie de biosynthèse du cholestérol à différents points. La fatostatine est une petite molécule inhibitrice de la synthèse du cholestérol qui bloque l'activation des SREBP-1 et -2, principaux régulateurs de la synthèse du cholestérol et des acides gras26. La fluvastatine inhibe directement l'HMG-CoA réductase, l'enzyme limitant la vitesse de la biosynthèse du cholestérol27. Les deux médicaments ont également été utilisés pour inhiber la synthèse du cholestérol dans le neuroblastome, une tumeur maligne dérivée du NCC. Pour identifier la concentration de travail idéale de fatostatine dans les cellules O9-1, nous avons d'abord mesuré les changements dans l'expression des gènes de synthèse du cholestérol et la viabilité cellulaire. Nous avons choisi une gamme de concentrations (5 à 25 µM) basée sur des expériences antérieures menées dans des cellules embryonnaires28. Nous avons identifié des concentrations de fatostatine et de fluvastatine qui n'étaient pas toxiques pour le cNCC via le test de viabilité des cellules vivantes Incucyte basé sur la confluence cellulaire (Fig. 3A). La fatostatine a significativement réduit la viabilité de la cNCC O9-1 à 25 µM. La fatostatine a considérablement réduit les niveaux d'ARNm de Srebf2, Hmgcr, Hmgcs1, Lss et Mvd à 10 µM et 25 µM après 48 h de traitement (Fig. 3B). Sur la base de ces résultats, nous avons sélectionné 10 μM comme concentration minimale qui provoquerait une inhibition de la synthèse du cholestérol sans altérer la viabilité cellulaire pour des études ultérieures. Pour valider la suppression observée de la biosynthèse du cholestérol par la fatostatine et la fluvastatine, nous avons directement mesuré les taux de cholestérol à l'aide du test Amplex Red dans des cellules O9-1 dans des conditions HG, CG, NG et NG2P. En présence de 10 µM de fatostatine, les taux de cholestérol total et estérifié ont été significativement abaissés dans toutes les conditions de glucose et les taux de cholestérol libre ont diminué dans les conditions NG et NG2P (Fig. 3C). En présence de fluvastatine 10 µM, les taux de cholestérol total étaient inférieurs dans CG et NG2P, les taux de cholestérol estérifié étaient inférieurs uniquement dans CG. Les niveaux de cholestérol libre ont diminué dans HG, CG et NG2P après le traitement par la fluvastatine. Ainsi, la fatostatine était plus puissante pour supprimer les taux de cholestérol total et estérifié que la fluvastatine, probablement parce qu'en bloquant SREBP-2, elle a le potentiel d'avoir un impact sur l'ensemble de la voie de biosynthèse du cholestérol.

Inhibition de la synthèse du cholestérol dans le cNCC O9-1. (A) Viabilité de O9-1 cNCC cultivé pendant 48 h en présence de fatostatine ou de fluvastatine à 5, 10 et 25 µM par rapport aux conditions de véhicule (« 0 »). n = 3 par groupe. (B) Niveaux d'expression génique de Srebf2, Hmgcr, Hmgcs, Lss, Mvd normalisés aux niveaux 18S dans des cellules cultivées en HG traitées avec 0 (véhicule), 5, 10 et 25 µM de fatostatine. (C) Taux de cholestérol total, estérifié et libre normalisés aux protéines dans le cNCC cultivé dans des conditions HG, CG, NG et NG2P en l'absence (véhicule) ou en présence de 10 µM de fatostatine de fluvastatine. n = 3 par groupe. Les valeurs sont indiquées sous forme de moyenne ± SD. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

La mort cellulaire programmée dans le CNCc est au cœur de la structuration/mise en forme craniofaciale29. Il a été démontré que la disponibilité du glucose, en particulier les augmentations élevées induites par le glucose des espèces réactives de l'oxygène, influence l'apoptose du cNCC9. De plus, des études ont montré que la fatostatine et la fluvastatine, un inhibiteur direct de la HMG-CoA réductase, possèdent des effets apoptotiques30,31,32,33. Nous nous sommes donc intéressés à l'examen de l'effet des inhibiteurs du cholestérol sur la sensibilité du cNCC à l'apoptose dans différentes conditions de glucose. Comme prévu, l'augmentation du glucose a entraîné une augmentation d'environ 20 fois de l'apoptose qui a atteint une signification statistique au dernier moment en l'absence d'inhibiteurs de la synthèse du cholestérol (Fig. 4A). L'examen de l'apoptose en présence d'inhibiteurs de la synthèse du cholestérol a révélé que seul le traitement par la fatostatine entraînait une augmentation de l'apoptose (aucune différence appréciable entre la fluvastatine et les conditions du véhicule) et que son effet était indépendant du glucose (Fig. 4B).

La régulation par le glucose du métabolisme du cholestérol peut jouer un rôle dans la mort cellulaire programmée du cNCC. (A) L'apoptose dans le cNCC cultivé dans des conditions HG, CG, NG et NG2P, tracée en fonction de la disponibilité du glucose pour examiner les effets de l'inhibition de la synthèse du cholestérol, a été mesurée via le test d'apoptose Incucyte live-cell Casp3/7. n = 6 puits/état ; plusieurs images par puits ont été collectées pour 3d. (B), l'apoptose dans le cNCC cultivé dans des conditions HG, CG, NG et NG2P en l'absence (véhicule) ou en présence de 10 μM de fatostatine ou de fluvastatine a été mesurée via le test d'apoptose Incucyte live-cell Casp3/7. Chaque barre représente la moyenne ± SD. ****p < 0,0001.

La migration à partir du tube neural étant un élément essentiel de l'ontogénie du cNCC, nous avons demandé si le blocage de la synthèse du cholestérol affectait la migration du cNCC (Fig. 5A, B). La migration a été mesurée via un test conventionnel de blessure par égratignure dans lequel les cellules sont autorisées à atteindre une confluence totale avant qu'une blessure ne soit introduite dans la monocouche cellulaire pour induire la polarisation cellulaire et la migration dans l'espace résultant (Fig. S2 supplémentaire). La largeur de la plaie était significativement plus élevée en présence de fatostatine dans les conditions CG et NG, ce qui correspond à une diminution de la capacité migratoire. Le traitement à la fluvastatine a également entraîné une augmentation de la largeur de la plaie par rapport au traitement par véhicule dans le CG et le NG ; cependant, cet effet n'a atteint une signification statistique que dans la condition CG. La concentration de glucose seule n'a pas affecté la migration du cNCC O9-1 (Fig. 5B).

La biosynthèse du cholestérol joue un rôle dans la migration des cNCC. (A) La migration cellulaire de cNCC cultivée dans des conditions HG, CG, NG et NG2P en l'absence (véhicule) ou en présence de 10 μM de fatostatine ou de fluvastatine a été examinée dans un analyseur de cellules vivantes Incucyte via un test de blessure par égratignure. n = 4 par groupe ; plusieurs images par puits ont été collectées toutes les heures pendant 36 h. Le panneau (B) présente les mêmes données en l'absence d'inhibiteurs de la synthèse du cholestérol pour mettre en évidence l'effet de la disponibilité du glucose. Chaque point de données représente la moyenne ± SD. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Les cNCC sont des cellules souches multipotentes qui donnent naissance à un certain nombre de types de cellules au cours du développement, notamment les neurones crâniens, la glie, les cellules musculaires lisses, les ostéoblastes et les chondrocytes30,34,35. De plus, des mutations dans les gènes de la voie de synthèse du cholestérol ont été associées à une dysmorphie faciale résultant d'une modulation aberrante de la différenciation des chondrocytes médiée par la signalisation WNT43,44.

Pour évaluer si les niveaux de cholestérol affectent le potentiel de cNCC à se différencier en chondrocytes36,37, nous avons effectué un test de chondrogenèse avec des cellules O9-1 dans des conditions HG et CG car nous étions particulièrement intéressés à comparer les conditions supraphysiologiques (apparentées à l'hyperglycémie) et physiologiques (euglycémiques) (Fig. 6). Les cellules O9-1 ont été cultivées dans un milieu de différenciation ostéogénique pendant 3 jours avant la culture dans un milieu de différenciation chondrogénique pendant 7 jours, comme décrit précédemment35. Le traitement avec 10 µM d'inhibiteurs de la synthèse du cholestérol tout au long du processus de différenciation de 10 jours a entraîné une confluence cellulaire disparate dans les différentes conditions de glucose ; toutes les expériences de différenciation ont donc été menées en présence de 5 µM de fatostatine et de fluvastatine. La quantification du bleu Alcian - utilisé pour colorer spécifiquement les polysaccharides acides présents dans le cartilage - a montré que la fatostatine réduisait de manière significative la différenciation en chondrocytes dans les conditions HG et CG, tandis que la fluvastatine réduisait la différenciation dans la condition CG (Fig. 6B). Les taux de cholestérol total (mesurés à la fin de la chondrogenèse) reflétaient une tendance similaire : le cholestérol était diminué par le traitement à la fatostatine dans les conditions HG et CG par rapport au véhicule, tandis que le traitement à la fluvastatine entraînait une diminution du cholestérol uniquement dans la condition CG, ce qui correspond à un rôle du cholestérol dans la chondrogenèse (Fig. 6C).

La diminution de la synthèse du cholestérol éloigne le destin terminal du cNCC de la chondrogenèse. (A) Coloration au bleu Alcian de cNCC cultivé dans un milieu de chondrogenèse dans des conditions HG et CG en présence de véhicule ou de 5 µM de fatostatine et de fluvastatine. Les barres d'échelle sont de 50 µM. (B) Quantification spectrophotométrique des images du panneau A (puits d'échantillon de 4 cm2, n = 5 par groupe). (C) Niveaux de cholestérol total normalisés à la protéine dans le cNCC cultivé dans un milieu de chondrogenèse dans les conditions spécifiées (n = 3 par groupe). Chaque barre représente la moyenne ± SD. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Nous avons également examiné la capacité de cNCC à se différencier en cellules musculaires lisses dans des cellules O9-1 cultivées dans des conditions HG et CG en l'absence ou en présence de 5 μM de fatostatine et de fluvastatine (Fig. 7A). La quantification de l'immunofluorescence de l'actine des muscles lisses a montré que le blocage de la synthèse du cholestérol via un traitement à la fatostatine ou à la fluvastatine augmentait de manière significative la différenciation en cellules musculaires lisses dans les conditions HG et CG (Fig. 7B).

L'inhibition de la synthèse du cholestérol favorise les destins terminaux des muscles lisses. (A) Immunomarquage d'actine musculaire lisse de cNCC cultivé dans des conditions HG et CG en présence de véhicule, de fatostatine et de fluvastatine (5 µM). Les barres d'échelle sont de 50 µM. (B) Quantification de la densité d'intensité de fluorescence/zone de cNCC colorée avec de l'actine de muscle lisse représentée dans le panneau A. n = 5 cadres par groupe. Chaque barre représente la moyenne ± SD. ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

En reportant notre attention sur SMCHD1, nous avons demandé si la concentration de glucose seule et l'inhibition de la synthèse du cholestérol pendant la chondrogenèse pouvaient affecter l'expression de Smchd1 (Fig. 8A). Le traitement par la fatostatine a diminué l'expression de l'ARNm de Smchd1 dans les conditions CG et HG, tandis que le traitement par la fluvastatine n'a affecté l'expression de Smchd1 que dans la condition CG. La concentration de glucose pendant la chondrogenèse n'a pas affecté l'expression de Smchd1 (Fig. 8A). Au départ, cependant, l'expression de l'ARNm de Smchd1 était significativement augmentée dans HG par rapport aux conditions CG, NG et NG2P (Fig. 8B) dans les cellules O9-1.

Des niveaux élevés de glucose augmentent l'expression de Smchd1 dans cNCC. (A), niveaux d'expression du gène Smchd1 normalisés aux niveaux de β-actine dans le cNCC cultivé dans un milieu de chondrogenèse dans les conditions spécifiées (n = 3 par groupe). (B), Smchd1 a normalisé les niveaux d'expression génique (obtenus à partir de l'étude RNA-seq) dans le cNCC cultivé dans HG, CG, NG et NG2P (n = 3 par groupe). Chaque barre représente la moyenne ± SD. *p < 0,05, **p < 0,01.

Les NCC sont une population de cellules progénitrices embryonnaires précoces et multipotentes uniques aux vertébrés38. Ils proviennent de l'ectoderme embryonnaire et subissent une transition épithéliale à mésenchymateuse lorsqu'ils se délaminent et migrent dans tout le corps39, contribuant à une grande variété de structures, y compris, mais sans s'y limiter, le cartilage et l'os craniofaciaux, les muscles lisses, les mélanocytes, les myofibroblastes, les neurones périphériques/entériques et les cellules gliales40. La capacité migratoire étendue et la multipotence de la NCC sont associées à - et peuvent en dépendre - un recâblage du métabolisme, qui sert non seulement à répondre aux besoins énergétiques uniques de ces cellules, mais peut également fournir des métabolites qui modulent la transcription des gènes et influencent ainsi la différenciation. En nous appuyant sur des études antérieures soulignant le rôle central de la glycolyse dans ce processus3,8,9,10,20,41,42,43,44, nous avons cherché à élucider comment les perturbations de la disponibilité du glucose affectent la physiologie du cNCC. Nos données sur l'ARN-seq WGCNA et le cholestérol suggèrent que dans des conditions de glycémie élevée, comme pendant le diabète gestationnel, par exemple, l'estérification du cholestérol est supprimée.

Nous avons en outre étudié la pertinence biologique de la synthèse du cholestérol dans les processus centraux de la fonction cNCC. Nous avons obtenu une régulation négative significative des gènes de biosynthèse du cholestérol et des niveaux cellulaires de cholestérol via l'inhibition pharmacologique de la biosynthèse du cholestérol sans compromettre la viabilité cellulaire. Nous avons observé une diminution de la migration cellulaire (augmentation de la largeur de la plaie) avec la fatostatine (condition CG et NG) et la fluvastatine (CG et tendance avec la condition NG). Fait intéressant, l'inhibition de la synthèse du cholestérol n'a pas modifié de manière significative la migration des cellules O9-1 cultivées dans des conditions d'appauvrissement en glucose lorsqu'elles ont été complétées par du 2 × pyruvate. Bien qu'il ait été précédemment démontré qu'un flux glycolytique élevé était nécessaire pour une migration correcte de la NCC, nos résultats suggèrent également une interaction entre le pyruvate et la régulation de la migration de la cNCC médiée par le cholestérol qui mérite une enquête plus approfondie. Enfin, en présence de fatostatine (condition CG et HG) et de fluvastatine (condition CG uniquement), nous avons observé une diminution de la capacité de cNCC à se différencier en chondrocytes et un déplacement vers la formation de cellules musculaires lisses. La perturbation de la biosynthèse du cholestérol entraîne une signalisation Sonic-Hedgehog défectueuse, qui joue un rôle essentiel dans la prolifération et la survie du cNCC46,47. De plus, les radeaux lipidiques riches en cholestérol sont connus pour réguler la signalisation canonique Wnt, qui est impliquée dans la prolifération cellulaire et la détermination du destin cellulaire au cours du développement embryonnaire48. En effet, Castro et al. ont montré que l'inhibition de la synthèse du cholestérol chez le poisson zèbre entraînait des malformations faciales qui pouvaient être sauvées par un agoniste Wnt37. La signalisation Wnt est importante à la fois dans la chondrogenèse49 et le développement des muscles lisses50. Ainsi, il est possible qu'une modification de la signalisation Wnt favorise la différenciation vers un destin de muscle lisse au détriment des chondrocytes. Pris ensemble, nos résultats complètent les études précédentes36,37 et fournissent des preuves supplémentaires que le cholestérol intracellulaire peut être un signal endogène important qui aide à dicter le destin de la cNCC51.

Il n'y a pas eu d'études sur le NCC humain pour démontrer qu'ils sont capables de biosynthèse du cholestérol, cependant, le profilage transcriptionnel des cellules agressives de neuroblastome de souris et humaines, une tumeur maligne dérivée du NCC, a démontré une augmentation de la biosynthèse du cholestérol entraînée par le facteur de transcription sterol regulation-element binding protein-2 (SREBP-2)26. Des gouttelettes lipidiques ont également été identifiées dans le NCC du tronc migrateur et post-migratoire chez des embryons de souris E8.5–9.552, indiquant un réservoir potentiel de cholestérol. De plus, le syndrome de Smith-Lemli-Opitz, une affection humaine rare causée par un défaut de la 7-déshydrocholestérol réductase, est associé à des caractéristiques dysmorphiques affectant la tête (p. ex., microcéphalie), le visage (p. ex., fente palatine) et les extrémités (p. ex., poly- ou syndactylie) ainsi que des malformations cardiaques et intestinales (aganglionose) qui peuvent en partie refléter une altération de la fonction NCC53. Enfin, des études antérieures sur des poissons zèbres portant des mutants HMGCS et HMGCR, des enzymes critiques dans la voie de biosynthèse du cholestérol, ont identifié des malformations du cartilage crânien dues à une différenciation déficiente de la NCC, ce qui est cohérent avec nos données utilisant des inhibiteurs du cholestérol pendant la chondrogenèse dans la cNCC O9-1.

Compte tenu de la variabilité phénotypique dans notre cohorte d'arhinie et de notre intérêt pour les modificateurs environnementaux potentiels agissant in utero, nous nous sommes également intéressés aux effets de la disponibilité du glucose et du cholestérol sur l'expression de Smchd1 au cours de la chondrogenèse. Nous avons observé que l'expression de l'ARNm de Smchd1 était augmentée à des niveaux de glucose plus élevés et qu'elle était plus faible à la fin de la chondrogenèse en présence de fatostatine (HG et CG) et de fluvastatine (CG). Ainsi, l'expression de Smchd1 semble être sensible à la fois à la disponibilité du glucose et à la teneur en cholestérol cellulaire (au cours de la chondrogenèse). Si les mutations faux-sens humaines de SMCHD1 agissent en fait de manière à gagner de la fonction16, une augmentation de l'expression de Smchd1 entraînée par une glycémie plus élevée pourrait éventuellement exacerber le phénotype, alors qu'une diminution de l'expression au cours de la chondrogenèse pourrait créer un phénotype plus doux (par exemple, hypoplasie nasale ou anosmie). Il est également concevable qu'une femme puisse être exposée sans le savoir à des statines d'origine naturelle et fongique pendant la grossesse. Bien que les statines n'aient pas été définitivement liées aux malformations congénitales55,56, l'exposition aux statines in utero pourrait modifier les effets phénotypiques d'une mutation SMCHD1 existante, contribuant à une diminution de l'activité répressive médiée par SMCDH1 et à la variabilité des phénotypes humains parmi les porteurs de la mutation SMCHD115.

Dans l'ensemble, notre étude démontre un rôle crucial pour une nouvelle modulation de la cholestérolémie médiée par le glucose qui agit comme « gardien » de la physiologie et de la fonction du cNCC, fournissant des signaux métaboliques qui influencent la prolifération, la migration et la différenciation cellulaires. Le cholestérol joue un rôle important dans la migration et la différenciation des cellules cNCC de souris vers une lignée chondrogénique ou myogénique, un processus de modulation important qui est atténué par des concentrations supraphysiologiques de glucose telles que celles observées dans le diabète gestationnel. Nous démontrons également que l'expression du répresseur épigénétique, Smchd1, est sensible au glucose (dans les milieux O9-1) et au dosage du cholestérol pendant la chondrogenèse, fournissant une confirmation supplémentaire du lien entre le cholestérol, la physiologie du cNCC et le développement craniofacial. D'autres études, y compris si oui ou non la régulation positive du cholestérol peut sauver ces phénotypes cellulaires, sont nécessaires pour délimiter les fondements mécanistes de cette régulation médiée par le cholestérol du comportement de la cNCC dans des conditions de disponibilité variable du glucose.

Les cellules O9-1 étaient un cadeau de K. Shpargel (UNC-Chapel Hill). Les cellules ont été développées sur des puits recouverts de Matrigel à 37 °C, 5 % de CO2 dans des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) conditionnés dans un milieu de base additionné de 25 ng/mL de facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF, R&D Systems) et de 1 000 U/mL de facteur inhibiteur de la leucémie (LIF, Millipore) comme décrit précédemment3. Pour les analyses RNAseq et cholestérol, les cellules ont été ensemencées à 10-15 000 cellules/cm2 et récoltées 48 h après avoir atteint > 80 % de confluence.

Des échantillons d'ARN pour qPCR et RNAseq ont été extraits de cultures en triple de cellules O9-1 cultivées dans diverses conditions de substrat et purifiées à l'aide du RNeasy Mini Kit (QIAGEN). La concentration d'ARN a été mesurée avec le kit de dosage Qubit™ RNA HS et un fluorimètre (Invitrogen).

Les bibliothèques ont été générées à l'aide du kit de préparation de bibliothèque d'ARN TruSeq v2 (Illumina, RS-122–2001) conformément aux instructions du fabricant. Les bibliothèques purifiées ont été quantifiées sur un bioanalyseur Agilent Technologies 2100 avec un kit d'ADN haute sensibilité Agilent. Les bibliothèques ont été séquencées sur une plate-forme Illumina NovaSeq 6000 pour générer des lectures à extrémité unique de 150 paires de bases. Le logiciel FastQC57 a été utilisé pour évaluer la qualité du séquençage et les lectures avec un score de qualité phred < 20 ont été rejetées. Les lectures de haute qualité restantes ont été alignées sur le génome de référence de la souris (mm10) avec l'aligneur STAR58. L'utilitaire featuresCounts du package Subread a été utilisé pour quantifier les lectures alignées sur les gènes de souris Gencode v.32 et l'analyse de l'expression différentielle a été effectuée à l'aide de DeSeq259,60. Les gènes avec un changement de facteur log2> 1 et un p ajusté à Bonferroni <0, 05 ont été considérés comme exprimés de manière différentielle.

Les valeurs d'expression normalisées ont été obtenues à l'aide de la méthode DeSeq2 de la médiane des rapports60. Les gènes informatifs pour l'analyse pondérée du réseau de co-expression génique (WGCNA) ont été sélectionnés sur la base d'une grande variabilité et avec des valeurs d'expression normalisées> 5 dans la moitié des échantillons. WGCNA a été réalisé à l'aide de l'utilitaire blockwiseModule avec le paramètre : soft threshold = 22, networkType = "signed", TomType = "signed", deepSplit = 2, minClusterSize = 30, cutTreeDynamic = 0,2522. Les modules avec un seuil de similarité supérieur à 0,25 ont été fusionnés. Les gènes avec une appartenance au module> 0,6 pour le module attribué ont été sélectionnés pour l'analyse de la voie avec le progiciel R gProfileR61.

Le package WGCNA du logiciel R (v 4.1.2) (v 1.71 ; https://bmcbioinformatics.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2105-9-559?ref=https://githubhelp.com )22 a été utilisé pour les panels de la Fig. module, et le substrat de glucose est illustré à la Fig. 1. Valeurs de corrélation de Pearson entre la valeur propre du gène du module et la disponibilité du substrat ; glucose élevé (HG = 25 mM de glucose, 1 mM de pyruvate), contrôle du glucose (CG = 5,55 mM de glucose, 1 mM de pyruvate), pas de glucose (NG = 0 mM de glucose, 1 mM de pyruvate) et pas de glucose avec 2 × pyruvate (NG2P = 0 mM de glucose, 2 mM de pyruvate) avec des valeurs p ajustées (entre parenthèses) sont indiqués dans chaque bac ; une corrélation de 1 ou -1 indique une forte relation positive ou négative, respectivement. Par exemple, la corrélation positive pour le module bleu indique que les gènes de ce module ont augmenté l'expression des gènes lorsque le substrat passe des conditions expérimentales HG aux conditions expérimentales NG2P. À l'inverse, les gènes attribués au module turquoise ont une expression réduite lorsque le substrat passe des conditions HG aux conditions NG2P.

Les lipides ont été extraits à l'aide du kit d'extraction de lipides (Abcam) selon les instructions du fabricant. En bref, les culots cellulaires congelés ont été traités avec un tampon d'extraction, et ils ont été centrifugés à 10 000 × g pendant 5 min, et les surnageants ont été transférés dans un tube propre et séchés à 37 ° C pendant la nuit. Les extraits ont été remis en suspension dans 50 µL de tampon de remise en suspension. Les taux de cholestérol total ont été mesurés à l'aide du kit Amplex Red Cholesterol Assay (Invitrogen) conformément aux spécifications du fabricant. La fluorescence de l'échantillon a été mesurée par excitation à 550 nm et détection d'émission à 590 nm. Les niveaux de cholestérol ont été normalisés aux niveaux de protéines et les résultats exprimés en pourcentage des niveaux de cholestérol dans des conditions de véhicule HG.

Des tests d'apoptose Casp3/7 de cellules vivantes Incucyte automatisés en temps réel62 ont été effectués sur des cultures à environ 30 % de confluence. Les tests ont été effectués à l'aide d'un système d'analyse de cellules vivantes Incucyte (Sartorius) via un traitement direct avec des colorants Incucyte Caspase-3/7, une surveillance par imagerie accélérée (toutes les 2 h pendant 3 jours) et une quantification de l'apoptose à l'aide du module logiciel d'analyse cellule par cellule d'Incucyte63 (Essen Bioscience). En bref, les cellules O9-1 ont été ensemencées sur des plaques Incucyte Imagelock revêtues de Matrigel et cultivées dans des milieux appropriés jusqu'à ce que la monocouche cellulaire atteigne 100 % de confluence. Les plaies ont été créées à l'aide de l'outil Woundmaker pour créer des zones sans cellules précises et uniformes dans la monocouche cellulaire. Les puits ont été imagés toutes les heures pendant 36 h et la migration cellulaire a été quantifiée à l'aide du module Incucyte Scratch Wound Analysis Software64 (Essen Bioscience).

Les cellules O9-1 ont été ensemencées sur des puits recouverts de Matrigel dans un milieu de base. Les cultures monocouches ont été initialement traitées avec un milieu ostéogénique (α-MEM, 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,1 μM de dexaméthasone, 10 mM de β-glycérophosphate, 50 μg/mL d'acide ascorbique et 100 ng/mL de BMP2 (fournisseur) pendant 3 jours. Après 3 jours , les cellules ont été transférées dans un milieu chondrogénique (α-MEM, 5 % de sérum bovin fœtal (FBS), 1 % ITS (fournisseur), 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 10 ng/mL de TGF-β3 (fournisseur), 50 μg/mL d'acide ascorbique, 10 ng/mL de BMP2 (fournisseur), 0,1 μM de xaméthasone et pyruvate de sodium 1 mM) et cultivées pendant 7 jours.

La différenciation chondrogénique a été évaluée par coloration au bleu Alcian65. Le milieu a été retiré et les cellules lavées deux fois avec du DPBS. Les cellules ont ensuite été fixées dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 10 min à température ambiante. Les cellules ont été lavées et incubées dans une solution de bleu Alcian (Millipore) pendant 30 min ; les noyaux ont été colorés avec une solution Nuclear Fast Red (Abcam). La coloration au bleu Alcian a été mesurée par quantification spectrophotométrique des cellules dans des puits de 4 cm2/échantillon à 620 nm.

Les cellules O9-1 ont été ensemencées sur des puits recouverts de Matrigel dans un milieu de base. Les cultures monocouches ont été maintenues dans un milieu de différenciation musculaire lisse (DMEM, 10 % FBS, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine) pendant 7 jours et fixées pour les expériences en aval.

Pour détecter la différenciation des muscles lisses, les cellules ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 min à température ambiante, suivies d'une perméabilisation avec 0,4 % de Triton X-100/DPBS pendant 10 min. Les cellules ont été bloquées avec 10 % de BSA/0,1 % de Tween 20, incubées avec un anticorps d'actine de muscle lisse (Santa Cruz Biotechnology) et un anticorps secondaire marqué au fluorophore (Invitrogen); les noyaux ont été colorés avec Hoechst 33,342.

Les cellules O9-1 ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pH 7,4 pendant 10 min à température ambiante. Les cellules ont été perméabilisées avec du PBS 0,4% Triton X-100 pendant 10 min. Les cellules ont été bloquées avec 10% BSA PBS 0,1% Tween 20. Les cellules ont été incubées avec un anticorps d'actine musculaire lisse (Santa Cruz Biotechnology) dans 3% BSA PBS 0,1% Tween 20. Les cellules ont été incubées avec un anticorps secondaire marqué au fluorophore (Invitrogen) dans 3% BSA PBS 0,1% Tween 20. Les noyaux ont été colorés avec Hoechst.

L'ARN total a été rétrotranscrit avec le kit de synthèse d'ADNc iScript (Bio-Rad). La PCR quantitative en temps réel a été réalisée à l'aide d'un système en temps réel CFX96 avec un super mélange universel SYBR vert sso avancé (Bio-Rad). L'expression de la β-actine a été utilisée pour normaliser le gène d'intérêt dans chaque échantillon. Des PCR quantitatives en temps réel ont été mises en place en utilisant les amorces oligonucléotidiques β-actine F 5-CGCATCCTCTTCCTCCCTGG-3', β-actine R 5-GTGGTACCACCAGACAGCAC-3', Hmgcs F 5-TGATCCCCTTTGGTGGCTGA-3' ; Hmgcs R 5'-AGGGCAACGATTCCCACATC-3', Hmgcr F 5-ATCCTGACGATAACGCGGTG-3'; Hmgcr R 5'-AAGAGGCCAGCAATACCAG-3', 18S F 5-AAACGGCTACCACATCCAAG-3'; 18S R 5'-CGTCCCAAGATCCAACTAC-3', Lss F 5-GGGCTGGTATTATGGTGGT-3'; Lss R 5'-CTCGATGTGCAAGCCCCA-3', Mvd F 5-ATGGCCTCAGAAAGCCTCAG-3'; MvdR 5'-TGGTCGTTTTTAGCTGGTCCT-3', Smchd1 F 5'-GATGGCCTTGACAGCTCAAAC-3, Smchd1 5'-CGCCAAGTAAAACACAGATCCTT-3', Srebf2 F 5-GACCGCTCTCGAATCCTCTTATGG-3'; Srebf2R 5'-GTTTGTAGGTTGGCAGCAGCA-3'. Le changement de pli a été obtenu en calculant 2−ΔΔCt.

Les données ont été analysées à l'aide de Prism 9 (logiciel GraphPad). La signification statistique a été déterminée par une ANOVA unidirectionnelle avec le test de Dunnett pour les comparaisons multiples et une ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey pour les comparaisons multiples. Toutes les expériences ont été réalisées au moins trois fois. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SD, et le niveau de signification a été fixé à p < 0,05.

Les ensembles de données à l'appui des conclusions de cet article sont disponibles dans le référentiel Sequence Read Archive (SRA) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/), numéro d'accès : PRJNA883392.

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Ces auteurs ont contribué à parts égales : Florencia Pascual et Mert Icyuz.

Direction de la recherche clinique, Institut national des sciences de la santé environnementale, 111 TW Alexander Drive, MD D3-02, Research Triangle Park, NC, 27709, États-Unis

Florence Easter, Mert Icyuz, Elizabeth Van Gorder et Natalie D. Shaw

Laboratoire d'immunité, d'inflammation et de maladies, Institut national des sciences de la santé environnementale, 111 TW Alexander Drive, Research Triangle Park, Caroline du Nord, États-Unis

Peer Karmaus et Michael B. Fessler

Direction de la biostatistique et de la biologie computationnelle, Institut national des sciences de la santé environnementale, 111 TW Alexander Drive, Research Triangle Park, Caroline du Nord, États-Unis

Ashley Brooks

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FP : conception, conception et réalisation d'expériences, collecte de données, analyse et interprétation de données, rédaction d'un article, MI : conception et réalisation d'expériences, collecte de données, analyse et interprétation de données, rédaction d'un article, PK : analyse et interprétation de données, édition d'un article, AB : analyse et interprétation de données, édition d'un article, EV : réalisation d'expériences, MBF : conception, édition d'un article, NDS : conception, supervision d'expériences, analyse et interprétation de données, rédaction et édition d'un article. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Natalie D. Shaw.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Pascual, F., Icyuz, M., Karmaus, P. et al. La biosynthèse du cholestérol module la différenciation dans les cellules de la crête neurale crânienne murine. Sci Rep 13, 7073 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32922-9

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Reçu : 05 janvier 2023

Accepté : 04 avril 2023

Publié: 01 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-32922-9

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