Échantillon de microfantôme à diffusion 3D pour évaluer la précision quantitative des techniques de microscopie de phase tomographique - Le lac des cygnes de Shijiazhuang Co., Ltd

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 19586 (2022) Citer cet article

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Dans cet article, nous présentons une structure de diffusion biomimétique structurellement complexe, fabriquée avec une polymérisation à deux photons, et utilisons cet objet afin de comparer un système d'imagerie informatique. Le fantôme permet d'adapter la diffusion en modifiant ses degrés de liberté, c'est-à-dire le contraste de l'indice de réfraction et les dimensions de la couche de diffusion et intègre un test de qualité d'imagerie 3D, représentant une seule cellule dans le tissu. Bien que l'échantillon puisse être utilisé avec plusieurs techniques de microscopie 3D, nous démontrons l'impact de la diffusion sur les méthodes de reconstruction de la microscopie à trois phases tomographiques (TPM). L'une de ces méthodes suppose que l'échantillon est à faible diffusion, tandis que les deux autres prennent en compte la diffusion multiple. L'étude est réalisée à deux longueurs d'onde (visible et proche infrarouge), qui servent de facteur d'échelle pour le phénomène de diffusion. Nous constatons que le changement de la longueur d'onde du visible au proche infrarouge a un impact sur l'applicabilité des méthodes de reconstruction TPM. En raison d'une diffusion réduite dans la région du proche infrarouge, les techniques orientées vers la diffusion multiple fonctionnent en fait moins bien qu'une méthode visant des échantillons à faible diffusion. Cela implique la nécessité de sélectionner une approche appropriée en fonction des caractéristiques de diffusion de l'échantillon, même en cas de changements subtils dans l'interaction objet-lumière.

L'un des défis modernes de l'optique computationnelle est d'imager des échantillons de diffusion avec une haute résolution1. Cela peut être attribué au fait que les structures biologiques complexes telles que les sphéroïdes ou les organoïdes ont tendance à être des modèles plus pertinents que les cultures cellulaires 2D, par exemple pour la découverte de médicaments2. En outre, la plupart des techniques d'imagerie in vivo nécessitent que la lumière de sondage traverse la structure complexe d'un tissu, ce qui limite fortement les profondeurs d'imagerie en raison de la diffusion multiple. Cette demande stimule le développement de nouvelles méthodes1,3,4,5, cependant, il est difficile d'en sélectionner une appropriée en fonction de la force de diffusion de l'échantillon analysé. Pour cette raison, une méthode polyvalente, reproductible et quantitative pour l'évaluation de différents systèmes et algorithmes d'imagerie est essentielle pour déterminer leurs limites d'applicabilité en fonction des propriétés de diffusion de l'objet. Une possibilité consiste à utiliser des microfantômes calibrés comme cibles d'imagerie. Malheureusement, les microfantômes existants sont généralement à faible diffusion (par exemple, les microsphères à indice adapté) ou trop simplistes (par exemple, les microsphères à indice désapparié)6,7 par rapport aux types d'échantillons multicellulaires à diffusion hétérogène auxquels les méthodes de diffusion multiple sont destinées. Il s'agit d'une limitation critique lors de la caractérisation des méthodes d'imagerie computationnelle qui utilisent des solveurs non convexes, où la convergence itérative dépend de la complexité du paysage énergétique et s'associe directement à la complexité 3D d'un échantillon8.

Dans ce travail, nous présentons un microfantôme imprimé en 3D avec une distribution d'indice de réfraction (RI) à diffusion multiple. Pour ce faire, nous nous appuyons sur les développements récents de l'impression 3D via l'écriture laser directe9,10,11,12. Parmi les multiples techniques d'impression 3D disponibles13,14,15,16,17,18, nous avons choisi une polymérisation à deux photons qui permet l'impression 3D d'échantillons microfantômes avec une géométrie connue et un RI calibré. Comparé à d'autres implémentations d'écriture laser directe, il permet (1) de contrôler le RI avec une plage de modulation relativement élevée, (2) d'ajuster le contraste RI ou la force de diffusion après la fabrication en utilisant différents liquides d'immersion et (3) de manipuler et de mesurer le microfantôme de la même manière que les échantillons biologiques. Ensuite, nous présentons l'application du fantôme dans le domaine de la microscopie de phase tomographique (TPM), une technique qui a démontré des résultats d'imagerie biologique impressionnants dans des travaux antérieurs. Cependant, il est important de noter que toutes les méthodes d'imagerie computationnelle peuvent être évaluées avec la procédure proposée.

TPM est une méthode d'imagerie quantitative sans étiquette qui utilise des projections optiques à travers un échantillon semi-transparent selon différents angles d'éclairage pour reconstruire l'IR 3D de l'échantillon. Cette méthode a trouvé plusieurs applications en imagerie biologique, où l'IR est directement liée à la distribution de la masse sèche aux niveaux cellulaire et subcellulaire. L'indice de réfraction et la masse sèche sont connus pour être des facteurs cruciaux dans l'analyse de l'étape actuelle du cycle cellulaire19, de la structure cellulaire20,21, des effets photobiochimiques sur les cellules22, de l'influence de facteurs externes sur les paramètres cellulaires23,24 et bien d'autres. Compte tenu de la richesse des informations fournies par la masse sèche au niveau de la cellule unique, il existe une demande importante pour étendre la capacité d'analyser la masse sèche à de grands amas multicellulaires, à des tranches de tissus épais ou à des micro-organismes entiers. Cependant, pour reconstruire l'IR 3D, les méthodes TPM traditionnelles utilisent des hypothèses critiques dans leurs méthodologies de reconstruction computationnelle qui reposent sur la faible diffusion de l'échantillon25. Ces hypothèses limitent les échantillons à avoir des épaisseurs de l'ordre de quelques dizaines de microns seulement. Pour les échantillons épais et complexes, des cadres de reconstruction qui s'adaptent à la diffusion multiple doivent être utilisés. À cette fin, de nombreuses approches TPM ont été proposées ces dernières années qui introduisent de nouveaux cadres pour s'adapter à la diffusion multiple26,27,28,29,30,31. Notamment, ces approches utilisent des solveurs non linéaires et non convexes pour résoudre de manière itérative l'IR 3D d'un échantillon. Bien que ces méthodes aient démontré des résultats impressionnants dans la reconstruction de l'IR dans des échantillons à diffusion multiple, leur précision quantitative n'a pas encore été solidement caractérisée expérimentalement, et les résultats présentés ne permettent généralement pas de comparer différentes méthodes afin de sélectionner l'approche appropriée pour un niveau de diffusion donné dans un échantillon. La stratégie générale pour évaluer expérimentalement la précision quantitative des méthodes TPM consiste à reconstruire l'IR 3D dans des échantillons avec des distributions RI connues6,7,32. On ne peut pas s'attendre à ce qu'une méthode TPM à diffusion multiple qui produit des reconstructions RI 3D précises d'un microfantôme faiblement diffusant ou trop simpliste produise des reconstructions RI aussi précises pour des échantillons à diffusion multiple plus complexes, où la probabilité de convergence vers des minima locaux est considérablement plus élevée. Pour caractériser de manière robuste la précision quantitative des méthodes TPM à diffusion multiple, il est impératif d'utiliser des microfantômes avec un RI 3D connu qui imitent la complexité structurelle des types d'échantillons que les méthodes TPM sont destinées à imager. À notre connaissance, ces types de micro-fantômes à diffusion multiple de référence n'existent pas.

Dans cette section, nous présentons la conception du microfantôme imprimé en 3D et son application dans l'évaluation de trois méthodes de reconstruction TPM.

Le microfantôme de diffusion que nous avons conçu et imprimé en 3D consiste en une cible semblable à une cellule avec des structures de test internes33 intégrées dans une distribution pseudo-aléatoire de bâtonnets qui changent leur orientation à travers différentes couches (Fig. 1a). La largeur et la hauteur de chaque tige sont respectivement égales à 0,5 \(\upmu\)m et 1,8 \(\upmu\)m. La distance latérale entre les tiges dans chaque couche est randomisée entre 0,7 \(\upmu\)m et 3 \(\upmu\)m et les couches sont empilées verticalement tous les 1,4 \(\upmu\)m. La structure résultante est transparente (plus de 99 % de transmission pour le coefficient d'extinction de 0,1 mm\(^{-1}\)34) et à diffusion multiple35. La région de diffusion finale est un cube de 60 \(\upmu\)m \(\times\) 60 \(\upmu\)m \(\times\) 40 \(\upmu\)m avec un facteur de remplissage d'environ 25 % (fraction de volume occupée par le polymère).

(a) Vue en demi-coupe de la conception du microfantôme diffusant. (b) Image SEM d'une couche diffusante constituée de bâtonnets distribués de manière quasi aléatoire. (c) Barreau individuel comprenant une couche diffusante. ( d ) Visualisation de la distribution RI 3D de la cible d'imagerie - fantôme cellulaire. Les caractéristiques subcellulaires, telles que les cibles de résolution (indiquées dans l'encart) et les nucléoles cellulaires, sont enfermées dans un ellipsoïde tronqué de dimensions externes de 30 \(\upmu\)m \(\times\) 25 \(\upmu\)m \(\times\) 12 \(\upmu\)m, qui est ensuite intégré au centre des 60 \(\upmu\)m \(\times\) 60 \(\upmu\ )m \(\times\) 40 \(\upmu\)m cube diffusant.

La cible de type cellulaire incorporée dans les couches de bâtonnets distribués de manière aléatoire imite une seule cellule biologique enfermée dans un volume de diffusion, qui représente par exemple un tissu. La cellule-cible comprend des sous-structures qui permettent l'évaluation de la précision quantitative dans les systèmes d'imagerie TPM36. Des informations sur la procédure d'impression 3D sont données dans la Sect. "Fabrication de microfantômes à diffusion 3D". Les principales caractéristiques de la cellule cible comprennent des cibles de test de résolution, des nucléoles en suspension dans un noyau et une région de variation lente de l'IR (voir Fig. 1d). Notamment, la cible de test de résolution comprend des lignes avec une fréquence spatiale croissante37 jusqu'à 1667 lp/mm. En évaluant la fréquence spatiale maximale des lignes qui peuvent être distinguées dans la cible de test cellulaire, la résolution d'imagerie d'une méthode TPM de choix peut être caractérisée et potentiellement comparée à différentes méthodes d'évaluation de la résolution décrites par d'autres groupes de recherche. La distribution pseudo-aléatoire des bâtonnets qui composent la partie diffusante de l'ensemble du microfantôme est supprimée à moins de 0,5 \(\upmu\)m de la cellule cible et ne croise aucune des structures de test. Un modèle du fantôme est disponible dans le Dataset 140.

Trois méthodes de reconstruction TPM ont été mises en œuvre et évaluées par comparaison des reconstructions tomographiques du microfantôme proposé. Les méthodes sont : (1) Gerchberg-Paopulis avec contrainte de support (GPSC)41, (2) propagation de faisceau multi-tranches avec mesures de champ électrique (MSBP-E)42 et (3) propagation de faisceau multi-tranches avec mesures d'intensité uniquement (MSBP-I)31. Afin d'effectuer la comparaison, le fantôme a été mesuré avec le dispositif TPM et deux ensembles de données ont été composés à partir des mesures de champ dispersé à valeurs complexes du microfantôme éclairé à différents angles, en utilisant à la fois des longueurs d'onde de 633 nm et 835 nm. Pour GPSC et MSBP-E, ces ensembles de données ont été utilisés directement. Pour MSBP-I, seules les composantes d'amplitude ont été utilisées. Les mesures et leurs reconstructions RI 3D correspondantes sont disponibles dans le Dataset 140.

La figure 2 montre les résultats de la reconstruction pour les deux longueurs d'onde. Nous caractérisons la résolution latérale (x et y) des reconstructions TPM en visualisant les lignes de test de résolution à l'intérieur du microfantôme. Pour comparer quantitativement les trois méthodes de reconstruction TPM, des tracés en coupe horizontale et verticale à travers ces tests de résolution ont été générés en calculant la moyenne et l'écart-type des valeurs de pixel sur les lignes ou les colonnes adjacentes aux lignes blanches en pointillés aa et bb, par \(\pm 4\) pixels. Ces tracés en coupe sont présentés ci-dessous.

Comparaison des reconstructions tomographiques du microfantôme mesurées avec des longueurs d'onde de 633 nm et 835 nm et calculées avec 3 algorithmes. Les régions colorées ombrées entourant chacun des tracés 1D en bas représentent l'écart type.

La géométrie complexe connue et la distribution RI du microfantôme développé permettent de montrer que le changement de la longueur d'onde du visible au proche infrarouge a un impact sur l'applicabilité des méthodes de reconstruction TPM43,44. Les vues agrandies de la région de test de résolution après reconstruction du microfantôme à l'aide de l'algorithme GPSC avec une lumière de longueur d'onde de 633 nm révèlent des artefacts granuleux significatifs qui obstruent les caractéristiques de la ligne dans la région de test du microfantôme. Nous notons que ces artefacts sont fortement diminués lors de la reconstruction avec une lumière de longueur d'onde de 835 nm. Cela suggère qu'à une longueur d'onde de 633 nm, le microfantôme est trop diffusant pour que la GPSC soit applicable. La diminution des artefacts de reconstruction GPSC pour 835 nm correspond aux connaissances conventionnelles selon lesquelles les longueurs d'onde plus longues de la lumière sont plus résistantes à la diffusion que les longueurs d'onde plus courtes. Afin de confirmer que cette observation est due à une diffusion réduite et non à des caractéristiques de bruit différentes entre les deux sources lumineuses, nous avons analysé l'écart type du bruit de phase dans une région sans objet dans les ensembles de données d'entrée. Pour une lumière de longueur d'onde de 633 nm, un écart type de bruit de phase de \(\sigma = 0,10\) radians a été observé, tandis que pour une lumière de longueur d'onde de 835 nm, un écart type de bruit de phase de \(\sigma = 0,08\) radians a été observé. Compte tenu d'une si petite variation entre ces caractéristiques de bruit, nous concluons que le principal facteur de la qualité de la reconstruction GPSC qui affecte sa capacité à visualiser les lignes de test du microfantôme est la force de diffusion du microfantôme aux deux longueurs d'onde différentes.

Notamment, MSBP-E et MSBP-I utilisent la régularisation à variation totale (TV) afin de stabiliser la convergence du solveur itératif non convexe en présence de bruit45. En particulier dans le cas de l'utilisation d'une lumière de longueur d'onde de 633 nm, la régularisation TV se traduit par des reconstructions RI 3D avec moins de bruit par rapport aux reconstructions 3D calculées via GPSC, qui n'utilise pas la régularisation TV. Cela peut être directement visualisé dans les coupes transversales 2D de la Fig. 2 et est confirmé par les limites de l'écart type indiquées dans les tracés en coupe transversale 1D. Cependant, l'inconvénient de la régularisation est qu'elle a un effet de flou sur les fonctionnalités haute résolution. Étant donné que le microfantôme diffuse moins dans la lumière de longueur d'onde de 835 nm, seul le GPSC a réussi à reconstruire les lignes de test à haute fréquence spatiale dans le microfantôme. En règle générale, la force de la régularisation TV est réglée manuellement pour s'adapter aux facteurs expérimentaux et équilibrer le compromis entre l'obtention d'une stabilité itérative et une résolution d'imagerie élevée.

En termes de RI moyen, la connaissance de la distribution RI de vérité terrain du fantôme permet de comparer quantitativement les résultats de reconstruction avec GPSC, MSBP-E et MSBP-I. Nous voyons que toutes les méthodes capturent avec succès les caractéristiques de masse du microfantôme. Comme décrit ci-dessus, la reconstruction 3D via GPSC présente des artefacts granuleux lors de l'utilisation d'une lumière de longueur d'onde de 633 nm, probablement en raison de la diffusion multiple du microfantôme à cette longueur d'onde. En outre, MSBP-I produit des valeurs RI légèrement surestimées et souffre également d'artefacts spatiaux à basse fréquence (qui ont été observés dans d'autres techniques d'imagerie de phase à intensité uniquement46,47). D'autres travaux ont montré que MSBP-I démontre une plus grande précision lors de l'utilisation d'un éclairage partiellement cohérent, ce qui réduit considérablement le bruit cohérent31. Les travaux futurs peuvent inclure la répétition de cette analyse sur une plus large gamme de techniques de reconstruction TPM avec des microfantômes de diffusion plus complexes.

Avec les résultats présentés, nous montrons que le changement de la longueur d'onde d'éclairage affecte la nature diffusante du microfantôme. Plus précisément, bien que le microfantôme soit à diffusion multiple avec une lumière de longueur d'onde de 633 nm, il s'agit d'une diffusion faible avec une lumière de longueur d'onde de 835 nm. Cela indique naturellement que le choix optimal de la longueur d'onde d'éclairage doit être équilibré entre la résolution (\(\frac{\lambda }{NA}\) pour une projection unique) et l'intensité de diffusion. Comme cela a été montré, il existe des cas où, au lieu d'appliquer des méthodes de diffusion multiple, il est avantageux d'augmenter la longueur d'onde d'éclairage (diminuant ainsi la force de diffusion de l'échantillon) et d'appliquer une méthode basée sur le théorème de diffraction de Fourier qui n'utilise pas la contrainte de variation totale. Plus fondamentalement, cependant, nous avons montré que les microfantômes imprimés en 3D permettent une évaluation quantitative de la précision de la reconstruction RI 3D dans diverses méthodologies TPM. Cette capacité est importante lors du choix d'une méthode TPM optimisée pour des classes spécifiques d'échantillons et de conditions d'imagerie.

Les travaux futurs se concentreront sur le développement de méthodes pour quantifier les forces de diffusion des fantômes et relier ces quantités aux propriétés de diffusion de différents types de tissus. En cas de succès, cela nous permettrait de concevoir et de fabriquer (en utilisant les méthodes présentées) des structures microfantômes 3D pour imiter un large éventail de spécimens biologiques allant des grappes multicellulaires aux tissus en vrac et aux petits organismes. Une autre direction possible consiste à régler les paramètres de diffusion dans le fantôme pour caractériser les performances d'imagerie pour diverses techniques utilisées pour imager dans le tissu de diffusion, telles que la tomographie par cohérence optique ou la microscopie confocale à réflexion. Enfin, nous envisageons que l'on puisse exploiter la flexibilité de la polymérisation à deux photons pour fabriquer des microfantômes sur différents substrats (par exemple à l'extrémité de la fibre optique pour la tomographie par rotation d'échantillon), en utilisant des résines biocompatibles (pour combiner des cibles de test avec les cellules vivantes dans le volume de mesure unique48) ou modifier la résine avec des particules fonctionnelles18 (par exemple pour accueillir des systèmes qui mesurent également l'absorption49,50,51,52,53).

Nous présentons ci-dessous la (1) méthodologie avec laquelle nous imprimons en 3D des microfantômes à diffusion multiple ; (2) la conception optique des systèmes d'imagerie TPM que nous utilisons pour collecter expérimentalement les mesures de champ électrique de diffusion du microfantôme ; et (3) de courtes descriptions théoriques de trois algorithmes tomographiques qui ont été utilisés pour reconstruire l'IR 3D à partir des données mesurées.

Le fantôme est fabriqué à l'aide d'une lithographie laser à deux photons, dans laquelle un faisceau laser focalisé est balayé dans une résine liquide. La résine dans le volume focal du laser est localement polymérisée. Le réglage de la trajectoire de balayage et du temps d'exposition du faisceau laser permet de contrôler simultanément la géométrie imprimée en 3D (précision de l'ordre de 100 nm) et RI (précision de l'ordre de \(5 \times 10^{-4}\), maximum \(\Delta\)RI = 0,03 au sein de la structure) en trois dimensions. Nous avons utilisé Photonic Professional GT (Nanoscribe GmbH) équipé d'un objectif de microscope 1,3 NA 100\(\times\) et d'une platine de balayage piézo. Le fantôme est fabriqué dans la résine IP-Dip (Nanoscribe GmbH) sur une lamelle couvre-objet #1.5H (configuration dip-in54). Après fabrication, la structure a été développée dans du PGMEA (Acétate d'éther monométhylique de propylène glycol; 12 min), suivi d'alcool isopropylique (10 min) puis séché au sèche-cheveux. La méthodologie complète de fabrication et de validation des caractéristiques se trouve dans nos précédents travaux33.

Pour mener nos expériences d'imagerie TPM, le microfantôme a été immergé dans l'huile Zeiss Immersol 518F (RI\(_{632}\) nm = 1,5123), qui fournit un contraste RI similaire à celui des cellules immergées dans un milieu de culture. En utilisant des huiles d'immersion avec un RI variable, il est possible d'ajuster les propriétés de diffusion de la post-fabrication du microfantôme.

Dans ce travail, un système optique, comme le montre la Fig. 3a) a été utilisé afin d'étudier le fantôme de diffusion. Le système est un microscope TPM basé sur Mach-Zehnder55, fonctionnant dans une configuration à angle limité avec un échantillon stationnaire et un éclairage tourné avec un miroir galvo (Thorlabs GVS212/M)56. La recherche a été effectuée avec deux longueurs d'onde et il y avait donc deux versions modifiées du microscope tomographique présenté. La première version, \(\text {TPM}_{633}\) fonctionne avec la longueur d'onde \(\lambda =\) 633 nm et la seconde, \(\text {TPM}_{835}\) avec \(\lambda =\) 835 nm. Le faisceau d'entrée (S sur la Fig.3a) est délivré avec une fibre optique, collimaté puis divisé en objet et bras de référence. Dans le système \(\text {TPM}_{633}\), la source lumineuse était un laser à réseau de Bragg en volume (Necsel NovaTru Chroma 633 SLM), \(\text {S}_{633}\), fournissant un mode longitudinal unique et offrant une longue longueur de cohérence. Le système \(\text {TPM}_{835}\) utilisait une source balayée (Superlum Broadsweeper BS-840-2-HP, \(\Delta \lambda\)= 800–870 nm), \(\text {S}_{835}\) réglé sur \(\lambda =\) 835 nm. En raison de la différence de longueur de cohérence, un module de retard supplémentaire a été placé dans le faisceau de référence pour les mesures \(\text {TPM}_{835}\). Les cubes de séparation de faisceau dans ce travail ont été soit revêtus pour 400–700 nm ou 700–1100 nm selon la longueur d'onde utilisée. La distance focale de la lentille tubulaire TL1 était \(\text {EFL}_{633}\text {=}\) 150 mm et \(\text {EFL}_{835}\text {=}\) 200 mm respectivement. Les deux objectifs de microscope (MO1 et MO2) de la Fig. 3 étaient 100\(\times\) NA 1.3 Objectifs semi-plan-apochromatiques, corrigés à l'infini. La deuxième lentille tubulaire TL2 utilisée était soit \(\text {EFL}_{633}\text {=}\) 200 mm, soit \(\text {EFL}_{835}\text {=}\) 300 mm. Cela a fourni des grossissements \(M_{633}=-\,48.5\) et \(M_{835}=-\,72.7\). La caméra utilisée dans le système était un capteur CMOS dans les deux cas, avec une taille de pixel de 3,45 \(\mu m\) (JAI BM500GE) dans le cas de \(\text {CAM}_{633}\) et une taille de pixel de 5,5\(\mu m\) (Basler acA2040-180km) dans le cas de \(\text {CAM}_{835}\). Le grossissement minimum, qui est imposé par la taille des pixels et la longueur d'onde afin d'assurer un enregistrement correct de l'hologramme pour chaque projection57 est \(M_{633 min}=-\,44.2\) et \(M_{835 min}=-\,53.5\), qui est satisfait dans les deux cas. Un exemple d'hologramme est présenté sur la figure 3b). Les deux systèmes ont été réglés pour éclairer l'échantillon avec un scénario de balayage circulaire (voir Fig. 3d) à l'angle zénithal \(\theta =47^{\circ }\) et ont fourni 180 projections espacées à \(\varphi =2^{\circ }\). Un échantillon de la phase et de l'amplitude fournies par le système à 835 nm est présenté sur les figures 3c et e.

(a) Système de mesure TPM basé sur Mach-Zehnder. S, source de lumière ; GM, système galvo; TL1 et TL2, lentilles tubulaires ; MO1 et MO2 ; objectif de microscope ; SPL, plan d'échantillonnage ; FAO, appareil photo ; (b) hologramme acquis à l'illumination axiale de l'échantillon ; (c) amplitude d'une projection à \(\varphi =304^{\circ }\); (d) scénario de balayage circulaire utilisé dans la mesure. Angle de rotation : \(\varphi\), angle zénithal : \(\theta =47^{\circ }\) ; (e) phase de la projection.

Il y avait trois méthodes de reconstruction TPM différentes pour calculer l'IR 3D du microfantôme utilisé à des fins de comparaison. Les données pour chaque méthode ont été acquises grâce aux mesures de diffusion multi-angle capturées comme décrit dans la Sect. "Système de mesure". Nous fournissons une brève description de ces méthodes ci-dessous. Des descriptions complètes de ces procédés sont données dans les références respectives.

Pour fournir une norme de base à comparer aux algorithmes de reconstruction TPM utilisant des modèles à diffusion multiple, nous reconstruisons d'abord le RI 3D du microfantôme à l'aide d'une méthode TPM à faible diffusion. Nous utilisons spécifiquement l'algorithme de Gerchberg-Papoulis amélioré avec une contrainte supplémentaire de support d'objet fini (GPSC)41. Les champs électriques à valeurs complexes mesurés par nos systèmes TPM sont utilisés comme entrées. La procédure se déroule en deux étapes. Dans un premier temps, une distribution RI 3D tomographique initiale est reconstruite à partir des mesures de champ électrique avec une forte régularisation en variation totale45. Ceci est réalisé via la méthode d'optimisation Chambolle-Pock58 et mis en œuvre avec la boîte à outils de tomographie ASTRA59. Le résultat subit une binarisation et un support d'objet fini est généré. Deuxièmement, un algorithme classique de Gerchberg-Papoulis est utilisé, qui est une version itérative de la méthode d'inversion directe (également connue sous le nom de transformée de Wolf)60. Cette procédure itérative est basée sur le théorème de diffraction de Fourier61 et utilise une approximation de diffusion du premier ordre. Ici, la reconstruction et sa transformée de Fourier sont calculées en alternance et des contraintes sont appliquées : non négativité et support d'objet fini dans le domaine du signal, et reconstitution des projections d'origine dans le domaine fréquentiel.

Notre principale méthode pour modéliser la diffusion multiple est la méthode de propagation de faisceau multi-coupes (MSBP)62, qui a récemment montré des résultats prometteurs pour l'imagerie biologique42,63. Dans notre première implémentation de MSBP, nous utilisons le même ensemble de données de champ électrique exact utilisé par GPSC d'en haut. Une estimation initiale de l'IR 3D de l'échantillon est sélectionnée pour démarrer la procédure itérative. Ensuite, la méthode MSBP est utilisée pour simuler les mesures de diffusion résultant des ondes planes se propageant à travers l'IR 3D initial estimé de l'échantillon. Les champs diffusés résultant de cette simulation sont comparés à ceux obtenus expérimentalement avec nos systèmes TPM. L'erreur calculée entre les mesures simulées et expérimentales est rétropropagée à travers chaque couche de l'estimation de l'échantillon 3D pour modifier progressivement la valeur RI de chaque voxel. Des itérations continues répétant ces étapes aboutissent finalement à la convergence de l'estimation de l'échantillon 3D vers une solution stable à l'état d'équilibre. Nous avons implémenté le MSBP avec des mesures de champ électrique (MSBP-E) via l'algorithme d'apprentissage de la tomographie (LT)42. La procédure LT est un algorithme d'optimisation itératif avec une régularisation supplémentaire à faible variation totale (TV) appliquée à chaque itération pour assurer la convergence. Nous avons constaté que la méthode fonctionne mieux lorsqu'une estimation initiale est choisie comme point de départ du processus itératif. Dans cet article, nous utilisons la méthode d'inversion directe pour fournir l'estimation initiale.

Des travaux récents ont démontré que l'étape de mise à jour du gradient dans la méthode MSBP peut être reformulée pour reconstruire l'IR 3D à partir des seules mesures d'intensité non interférométriques31. Les principaux avantages de cette méthode comprennent l'utilisation d'un système d'imagerie non interférométrique, résistant aux instabilités mécaniques qui limitent souvent l'utilisation à long terme des interféromètres à double bras sans réalignement. De plus, la source lumineuse peut être partiellement cohérente, pour éviter des artefacts de speckle cohérents dans les mesures, tout en conservant une cohérence suffisante nécessaire à la reconstruction RI. Aux fins de démonstration de la reconstruction RI 3D à l'aide de cette variante d'intensité uniquement de MSBP (que nous appelons ici MSBP-I), nous utilisons simplement la composante d'amplitude des mesures de champ électrique utilisées pour les reconstructions GPSC et MSBP-E, décrites ci-dessus. Comme pour MSBP-E, la régularisation de la variation totale est appliquée à chaque itération. Le point de départ de MSBP-I est une matrice de zéros.

Toutes les méthodes de reconstruction TPM décrites sont des procédures itératives qui utilisent le même critère d'arrêt pour terminer automatiquement les calculs. Ce critère est une modification d'une méthode présentée précédemment64, et est décrit dans Alg. 1 ci-dessous. L'intuition générale derrière cette procédure est de terminer le processus de calcul itératif lorsque la dynamique du changement entre les estimations d'échantillons 3D issues d'itérations consécutives tombe en dessous d'un certain niveau de saturation \(\epsilon\). Afin d'être moins dépendant des valeurs aberrantes, la valeur médiane de la dynamique des 10 dernières itérations est calculée. La valeur de \(\epsilon\) est choisie empiriquement pour chaque algorithme. Pour GPSC \(\epsilon =0.02\), pour LT et MS \(\epsilon =0.01\). Les valeurs de \(\epsilon\) ont été choisies empiriquement pour équilibrer la convergence incomplète et la vitesse de reconstruction.

Les données sous-jacentes aux résultats présentés dans cet article sont disponibles dans l'ensemble de données 140.

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Les auteurs tiennent à remercier le prof. Maciej Szkulmowski de l'Université Nicolaus Copernicus pour avoir donné accès à la source de lumière proche infrarouge utilisée dans ce travail. Les auteurs tiennent à remercier Demetri Psaltis et Joowon Lim de l'École Polytechnique Fédérale de Lausanne pour avoir fourni le code de l'algorithme d'apprentissage de la tomographie.

La recherche menant aux résultats décrits a été menée dans le cadre du programme TEAM TECH/2016-1/4 de la Fondation pour la science polonaise, cofinancé par l'Union européenne dans le cadre du Fonds européen de développement régional. Le développement d'objets d'étalonnage a été financé par le projet FOTECH-1 accordé par l'Université de technologie de Varsovie dans le cadre du programme Excellence Initiative: Research University (ID-UB). Nous remercions également l'Université du Texas à Austin, la Cockrell School of Engineering et l'Initiative Chan Zuckerberg pour leur soutien.

Institut de micromécanique et photonique, Université de technologie de Varsovie, rue Boboli 8, Varsovie, 02-525, Pologne

Wojciech Krauze, Arkadiusz Kuś, Michał Ziemcznok & Małgorzata Kujawińska

Département de génie électrique, Université du Texas à Austin, 2501 Speedway, Austin, TX, 78712, États-Unis

Max Haimowitz et Shwetadwip Chowdhury

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Crédit. WK : conceptualisation, analyse formelle, méthodologie, logiciel, visualisation, rédaction–ébauche originale. AK : conceptualisation, acquisition de financement, enquête, méthodologie, administration de projet, visualisation, rédaction - ébauche originale. MZ : curation des données, enquête, méthodologie, ressources, visualisation, écriture–ébauche originale. MH : logiciel, rédaction–revue et édition. SC : acquisition de financement, logiciels, rédaction-révision et édition. MK : acquisition de financement, administration de projet, rédaction-révision et édition.

La correspondance est Wojciech Krauze.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Krauze, W., Kuś, A., Ziemczonok, M. et al. Échantillon de microfantôme à diffusion 3D pour évaluer la précision quantitative des techniques de microscopie de phase tomographique. Sci Rep 12, 19586 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24193-7

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Reçu : 31 août 2022

Accepté : 11 novembre 2022

Publié: 15 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-24193-7

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